石油等の化石燃料には有機硫黄化合物が含まれており、その燃焼によって発生する硫黄酸化物は大気汚染や酸性雨の原因物質となる。石油等の化石燃料には有機硫黄化合物が含まれており、その燃焼によって発生する硫黄酸化物は大気汚染や酸性雨の原因物質となる。ppm-S以下への段階的移行が予定されている。軽油中には現行の石油精製工程では除去が困難な有機硫黄化合物が存在し、その代表的なものがジベンゾチオフェン(以下DBT)およびそのアルキル誘導体である。WU-F1を単離し、それぞれの増殖菌体と休止菌体が実際の軽油に対して脱硫活性を示すことを確認した。して反応を行い、硫黄分の除去率を検討した。ppm-Sにまで脱硫可能であることを明らかにした。ppm-S未満を達成したことを明らかにしたもので極めて意義深い。以上の結果より、WU-F1の優秀性が明らかになったため、当該菌株を宿主とした高機能脱硫細菌の創製を目的とした宿主ーベクター系の開発と形質転換法について検討した。軽油中にはDBT誘導体以外に、非対称分子構造をとるナフトチオフェン(NTH)などの誘導体も含まれている。WU-K2Rを単離した。微量分析を駆使した中間代謝産物の解析から、WU-K2Rによる炭素ー硫黄結合を切断する脱硫機構を確定して、NTHについての硫黄原子特異的な分解機構の存在を初めて明らかにした。生体触媒を利用した立体選択的な反応の開発には新規かつ優良な酵素が必要とされる。生体触媒を利用した立体選択的な反応の開発には新規かつ優良な酵素が必要とされる。WU-9701株が生産することを発見し、これを利用した一段階の水系反応により効率的なメントール(清涼剤)の酵素的α-グルコシル化に初めて成功した。α-MenGは口中に含むと最初にほのかな甘味を示し、数分後に清涼感を発する性質を有しており、新規な食品素材として期待される。飽和濃度を越えてα-MenGが生産されるためこの水系反応は結晶蓄積型の反応として進行し、ろ過するだけでα-MenGを容易に回収することが可能であった。本研究では、遺伝子をクローニングし塩基配列を決定して当該酵素の一次構造を明らかにするとともに、組換え酵素を利用した効率的なα-グルコシド生産系の開発を行った。WU-9701株のDNAライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションを行い、目的の遺伝子(xgtA)をクローニングした。kDaのタンパク質をコードしており、これは精製酵素の分子量と一致していた。xgtAから推定される一次構造にはα-アミラーゼに共通して存在するモチーフが見出されたが、既知の酵素とは30-35%の相同性を示す程度で、とくにC末端側70アミノ酸残基で構成される領域については他の酵素との相同性は見出されなかった。WU-9701株と比較して約140倍の比活性を得ることに成功した。石油等の化石燃料には有機硫黄化合物が含まれており、その燃焼によって発生する硫黄酸化物は大気汚染や酸性雨の原因物質となる。石油等の化石燃料には有機硫黄化合物が含まれており、その燃焼によって発生する硫黄酸化物は大気汚染や酸性雨の原因物質となる。ppm-S以下への段階的移行が予定されている。軽油中には現行の石油精製工程では除去が困難な有機硫黄化合物が存在し、その代表的なものがジベンゾチオフェン(以下DBT)およびそのアルキル誘導体である。WU-F1を単離し、それぞれの増殖菌体と休止菌体が実際の軽油に対して脱硫活性を示すことを確認した。ppm-S未満を達成している(昨年度の成果も参照)。WU-F1の優秀性が明らかになったため、当該菌株を宿主とした高機能脱硫細菌の創製を目的としたDBT脱硫遺伝子の解析と宿主ーベクター系の開発について検討した。WU-F1のDBT脱硫に関与する遺伝子オペロンbdsABCをクローニングし塩基配列を決定したところ、異属であるにもかかわらず両者の遺伝子は同一であった。常温性細菌のDBT脱硫遺伝子とは61%の相同性しか示さず既知の遺伝子との相同性は極めて低いこと、遺伝子系統樹の作成からbdsABCが新規な遺伝子であることが明らかになった。bdsABCを異種の宿主細胞としての大腸菌内で高発現させることにも成功し、高温域を含む30-50度の広範な温度条件下においてDBTおよびDBTアルキル誘導体の効率的な脱硫が可能なことを確認した。bdsABCが有用であることを明らかにした。WU-F1にbdsABCを導入し遺伝子コピー数を増大させることによって、DBT脱硫比活性を原株の約2倍に増大させることに成功した。現在、産業上有用な芳香族ヒドロキシカルボン酸は有機化学的合成法により製造されているが、反応に高温高圧を要することや副生物との分離精製に複雑な過程を要することが問題点とされている。現在、産業上有用な芳香族ヒドロキシカルボン酸は有機化学的合成法により製造されているが、反応に高温高圧を要することや副生物との分離精製に複雑な過程を要することが問題点とされている。多大なエネルギーを必要とし環境への負荷が大きいことが未解決のままにされている。サリチル酸は芳香族ヒドロキシカルボン酸の代表的化合物で、解熱鎮痛薬であるアスピリン(アセチルサリチル酸)をはじめ各種医薬品の合成原料として重要であり、最近ではサリチル酸誘導体に血行改善作用や一部のがんに対する抑制効果が見出されたことから需要が高まっている。製造法はKolbe-Schmidt法に基づくフェノールに対する二酸化炭素固定によるもので、前述の問題点を抱えている。したがって、サリチル酸の生産プロセスを例として、常温常圧で副生物のない新規な合成法を考案することは、芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造法のみならず化学工業プロセスに共通する問題点を解決する端緒となるにちがいない。そこで、本研究では、サリチル酸の生産を目的として酵素等の生体触媒を利用した新規なバイオプロセスの開発を目的とした研究に着手した。筆者らは、フェノールの2位炭素(o-位)に二酸化炭素を位置選択的に固定する酵素を探索し、常温常圧条件下でのサリチル酸の選択的生産を可能にすることを目的とした研究を行った。既往の酵素にはこのような活性は見出されていなかったため、自然界から新規酵素を探索することとした。目的とする酵素の発見には、生成物としてのサリチル酸と基質としてのフェノールに関する定性および定量分析法が必要とされたためHPLCを利用した分析法を確立した。キノン系色素を利用した方法を採用し、微生物の培養液や酵素反応液など多検体の試料溶液に対してサリチル酸を容易かつ鋭敏に検出することを可能とした。これらを通して、広範な酵素の探索に対応しうるスクリーニング系を構築した。筆者らは日本各地から約500種類の土壌などの試料を収集し、フェノールからサリチル酸を選択的に生成する活性を初めて真核微生物に発見した。酵素の精製を通してこの活性が単一の酵素によるものであることを明らかにして、世界で初めて酵素によりフェノールからサリチル酸を選択的に生産することに成功した。休止菌体(あらかじめ培養した菌体)を生体触媒として利用する方法により、フェノールからのサリチル酸の選択的かつ効率的な生産を可能とした(注:特許申請に該当する内容もあり、微生物の具体的な属種や生産効率と生産量についてのデータを省略)。別種の酵素を利用して、サリチル酸誘導体としてのγ-レゾルシン酸の生産にも成功した。以上を通して、サリチル酸誘導体の生産を目的とした新規なバイオプロセスの基本型を開発した。本研究では、申請者らが発見した新規な酵素を利用した可逆的脱炭酸酵素を利用したバイオ生産プロセスの開発に関する研究を進めた。本研究では、申請者らが発見した新規な酵素を利用した可逆的脱炭酸酵素を利用したバイオ生産プロセスの開発に関する研究を進めた。2004)、当該酵素(以下Rdcと称する)の遺伝子をクローニングし、大腸菌を宿主として大量発現することに成功した。Rdcをコードする遺伝子に関してその機能を検証するため種々の部位に改変を加え、酵素機能の改変との関連性について検討した。その過程で、His164とHis218をAlaなどの他のアミノ酸に置換すると脱炭酸活性と炭酸固定活性の両者が消失するため、His164とHis218の2つのアミノ酸残基がRdcの活性発現に必須なことを見出した。数箇所のアミノ酸の改変により活性の向上や一部機能の改変が可能なことを明らかにした(注:知的所有権保持などの観点から詳細省略)。unit/mgの組換えRdcが得られた(活性の表示は可溶化タンパク当たりの比活性として表示)。WU-0108によって得られるRdcの活性と比較して約4倍に相当し、組換えRdcの単離精製も容易に行えることを確認した。「組換えRdcを保持する生体触媒」として利用しgamma-レゾルシン酸生産が可能なことを明らかにした。dry-cells/L)となるように反応溶液中に分散させ、gamma-レゾルシン酸生産の生産試験を行った。mMのgamma-レゾルシン酸を生産することが可能であった。以上より、研究室レベルでのgamma-レゾルシン酸生産バイオプロセスの構築に成功した。医薬品の原料として大きな用途がある。当該バイオプロセスを利用して多種の芳香族ヒドロキシカルボン酸を生産することも可能である。min)で反応液から用意に回収することが可能で、少なくとも5回までは再利用が可能であり、バイオ生産プロセスの利用において大きな特色と考えられる。本研究を通じて、自然界から単離した真核微生物にサリチル酸デカルボキシラーゼを発見した。本酵素も芳香族ヒドロキシカルボン酸の生産に利用可能で、バイオ生産プロセスへの適用性も見出している。発芽し、多細胞かつ多核の菌糸を形成し成長を行う。発芽し、多細胞かつ多核の菌糸を形成し成長を行う。したがって、クロコウジカビの胞子は形態的な変化や分化を観察可能な極めて有用なモデル細胞と考えることができる。oxidaseおよびその遺伝子(aox1)を素材とした蛍光顕微鏡下での非破壊的観察を可能にする実験系を構築した。oxidaseの活性が消失していることを確認した。つぎに、aox1のプロモーターの下流にaox1とegfp(緑色蛍光タンパク)の融合遺伝子を連結し、これをDAOX-1株に導入してAOXEGFP-1株を作製した。oxidaseの活性が検出され、EGFPによる緑色蛍光がミトコンドリアと同位置に観察されることから、融合遺伝子aox1-egfpが発現していることを確認した。oxidase活性とEGFPの緑色蛍光をマーカーとして追跡可能な実験用菌株の作製が可能なこと、その代表株としてAOXEGFP-1株が利用可能なことを明らかにした。菌糸は糸状の多細胞で老若細胞が混在することから、aox1の発現を経時的にあるいは定量的に測定することが困難であった。oxidase活性やシアン非感受性呼吸活性が検出された。これは、胞子の状態でaox1の発現あるいはシアン非感受性呼吸活性が検出された初めての成果である。解析ソフトで1胞子ごとのEGFP蛍光量を計測し、100個以上についての測定値を平均することで定量的で再現性のある1胞子当たりの蛍光量を測定することを可能にした。非栄養条件下で胞子懸濁液に種々の酸化ストレスを与えることや抗酸化剤(酸化ストレス緩和剤)を添加することを行い、EGFPの蛍光強度とシアン非感受性呼吸に相関があることを明らかにした。1細胞ごとに区画してEGFPを指標としたaox1の発現を定量的に計測することや経時的に変化を与えることでEGFPの蛍光強度が変化することを明らかにして、細胞内の酸化ストレスをモニタリングすることが可能なことを明らかにした。以上を通して、クロコウジカビの胞子をモデルとした細胞内酸化ストレスの1細胞定量的モニタリングに成功した。今後は、本実験系を利用して種々の酸化ストレスに関する細胞の応答を簡便に試験することなどが可能になると考えている。型PKS)を活用した新規機能性分子の生産に関する研究を実施した。型PKS)を活用した新規機能性分子の生産に関する研究を実施した。糸状菌由来のIII型PKS遺伝子をクローニングし、大腸菌で当該遺伝子を高発現させることで新規な特徴を明らかにした。開始基質として利用可能で、従来の糸状菌由来III型PKSとは異なる機能を有していることを明らかにした。試験管内での酵素反応系リデザインにより新規機能性分子の生産について検討した[1]。新規酵素の候補として新規なネオアガロオリゴ糖加水分解酵素[2]やネオアガロビオース生成型の新規アガロース加水分解酵素[3]を精製し、酵素的諸性質を明らかにした。niger(クロコウジカビ)の有機酸輸送系の観点からクエン酸やシュウ酸生産の改変を目的とした研究を実施した。niger(クロコウジカビ)の有機酸輸送系の観点からクエン酸やシュウ酸生産の改変を目的とした研究を実施した。申請者らは、供試菌としてWU-2223L株(原株)を使用し、ミトコンドリア膜局在型の有機酸輸送系の1つ(仮称CXXA)に着目し、相当する遺伝子の破壊株(ΔcxxA)を作製した。ΔcxxAの表現型は原株のそれと同一であった。所定時間培養後のクエン酸生産量はΔcxxAでは約56%に激減していた。これは、CXXAをコードする遺伝子がクエン酸高生産に関与していることを明示した初めての成果である[1]。高発現させた株による高効率シュウ酸生産株の創製に成功した[3]。寒天オリゴ糖には種々の生理活性機能を示すものがあり、医薬品や機能性食品などへの利用が期待されている。本研究では、新規β-アガラーゼを利用した機能性寒天オリゴ糖の新規生産について検討を行った。寒天オリゴ糖には種々の生理活性機能を示すものがあり、医薬品や機能性食品などへの利用が期待されている。本研究では、新規β-アガラーゼを利用した機能性寒天オリゴ糖の新規生産について検討を行った。WU-0601より、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーを経て、新規β-アガラーゼの精製を達成し、諸性質を決定した。本酵素はアガロースを加水分解し、最終的にはネオアガロビオースのみを生成するという特長を有していた。探索を行い、複数の耐熱性アガラーゼ生産候補株を取得した。現在,化石燃料中の硫黄分の燃焼により発生する硫黄酸化化合物は,大気汚染や酸性雨の原因となるため,環境保全の観点から問題視されている。現在,化石燃料中の硫黄分の燃焼により発生する硫黄酸化化合物は,大気汚染や酸性雨の原因となるため,環境保全の観点から問題視されている。化石燃料の燃焼前の脱硫も実施されているが,ジベンゾチオフェン(以下DBTと略)のような芳香族硫黄化合物は除去が困難である。脱硫処理は高温高圧条件下で行われる物理化学的プロセスに依存しており,地球環境への負荷も大きい。開発にも期待が寄せられている。本研究においては,難分解性の有機硫黄化合物のモデルとしてDBTを使用して,硫黄を遊離する微生物を探索した。日本各地の各種土壌や原油スラッジを試料として,DBTを唯一の硫黄源として利用可能な微生物を集積し,純粋分離して数種の細菌を取得した。酸素を利用して酸化的にDBTを利用する細菌としてはGordona属のMX-1株が優良株であるり,培養に伴い50mg/lのDBTを3日間でほぼ完全に分解した。DBTの消費量と比例して2-ヒドロキシビフェニルの蓄積が認められたため,分解経路はDBT,DBTスルホン,2-スルホビフェニルを経由して硫酸イオンとして硫黄原子が酸化されたものと判断された。MX-1株は好アルカリ性細菌であることも判明し,新規な脱硫プロセスに利用可能と考えられる。窒素置換した条件下でDBT分解を行う微生物も取得した。酸素非存在下での脱硫は爆発等の危険を回避しうるため望ましいものであるが,取得した微生物の菌学的同定は現在進めている途中で,DBT分解経路に関する詳細は不明である。100mg/lのDBTを2週間で40%,1g/lのチオフェンカルボン酸を4週間で完全に分解する細菌も取得されており,多様な条件下での微生物脱硫の可能性を示唆する結果が得られた。原油中に含まれる芳香族窒素化合物の代表的なものにカルバゾールがあり、石油精製の脱硫工程においても除去されずに残留する。原油中に含まれる芳香族窒素化合物の代表的なものにカルバゾールがあり、石油精製の脱硫工程においても除去されずに残留する。このような有機窒素化合物は燃焼によりNOX生成の原因物質となるため、環境汚染防止の観点から除去方法の確立が望まれている。カルバゾールおよびその誘導体は染料や樹脂の原料としても使用されており、地下水や土壌への蓄積も明らかになり環境保全の観点から問題視されている。高等動物の臓器や神経に障害を与えるため、環境中に放出されたカルバゾールの効率的除去方法の確立も必要であり、バイオレメディエーションに期待が寄せられている。そこで、本研究においてはカルバゾールを分解する微生物を探索し、分解代謝経路を明らかにして能力を評価した。カルバゾールを唯一の窒素源とした合成培地を使用して5株の分解細菌を取得した。CDH-7は培養に伴い500mg/lのカルバゾールを2日間で完全に分解し、極めて優れた能力を有することが判明した。培養過程ではアントラニル酸が検出されたものの最終的にはこれも消失し、アンモニウムイオンへと無機化された。カルバゾール分解代謝経路としては、ジオキシゲナーゼによる酸化反応を経て炭素・窒素間の結合が開裂してから芳香環が酸化され、アントラニル酸を経由してアミノ基がアンモニア態へと変化することが明らかになった。当該反応では有毒中間体の蓄積がない完全分解が可能であるため、CDH-7を休止菌体(増殖させない条件下で酵素活性を機能させる)反応に利用した。30時間培養して調製した菌体を緩衝液で数回洗浄したのち、100mg/lのカルバゾールに作用させた場合、30分で完全に消失した。この反応は10回の繰り返しが可能で、約24時間活性も維持された。ケロシン(灯油)存在下での反応も速やかに進行した。研究成果概要:海洋や土壌の汚染物質を分解または吸収する機能を有する微生物を利用して自然環境の保全または浄化を行うことが全世界的に検討され始めている。このような生物的環境浄化は病んだ地球を治癒するとの発想から、バイオレメディエーションと称されてい...海洋や土壌の汚染物質を分解または吸収する機能を有する微生物を利用して自然環境の保全または浄化を行うことが全世界的に検討され始めている。このような生物的環境浄化は病んだ地球を治癒するとの発想から、バイオレメディエーションと称されている。本研究においては、流出原油の微生物処理を目的として、新規な石油分解微生物の探索を行った。試料として、ケロシン(灯油)を唯一の炭素源とする集積培養を行い、石油分解能力を示す微生物の一次選択を行った。二次選択では、栄養分を含む寒天培地上に石油を塗布し、一次選択で集積した微生物の培養液を接種して好気および嫌気条件下で培養を行い、微生物集落周辺の石油が消失しているものを選択した。取得した微生物は単離して微生物学的同定を行った。単離した微生物に関しては、ヘキサデカン(炭素数18)の資化性を調べ、石油分解能力の指標とした。sp.等の細菌が選択された。原油に含まれるカルバゾールは難除去性の有機窒素化合物であり、流出原油事故ののちに環境に残留するため分解除去能力を示す微生物の取得が望まれていた。mg/lのカルバゾールを含む液体培地で好気的に培養すると3日間で完全にカルバゾールを分解除去することが確認された。g/lの濃度でカルバゾールを逐次添加した場合には、9回目までは完全分解が認められ、カルバゾールはアンモニアにまで無機化された。このような性質は実際の流出原油の処理に極めて有用と考えられる。タンカーの座礁や石油パイプライン事故の数は増加傾向にあり、これらの人為的災害によって流出した石油は世界的には年間数百万トンと見積もられている。タンカーの座礁や石油パイプライン事故の数は増加傾向にあり、これらの人為的災害によって流出した石油は世界的には年間数百万トンと見積もられている。これらは自然界において残留性が高いため、石油流出事故が起こった土壌では長期間にわたって汚染が継続することになるが適切な処理方法は確立されていない。筆者らは、生物機能を利用した環境浄化、いわゆるバイオレメディエーションに関する研究を進めている。モデルであるカルバゾールを分解する微生物を探索し、分解試験を行った。試料として、カルバゾール分解微生物を探索した。CDH-7を取得した。CDH-7はカルバゾールをアントラニル酸を経てアンモニアにまで無機化するが、有害な中間体を蓄積しない。他の有機化合物存在下においても選択的にカルバゾールを分解するとともに、アントラセンやフルオレン、ジベンゾフランなどが共存した場合にも分解能力は低下しなかった。mg/lのカルバゾール分解が可能であり、約90%をアンモニアにまで無機化することが可能であった。以上の性質は、CDH-7がバイオレメディエーションに適した細菌であることを示唆する。niger(クロコウジカビ)はミトコンドリア内に2つの呼吸経路を有している。niger(クロコウジカビ)はミトコンドリア内に2つの呼吸経路を有している。1つは通常のチトクロム系であり、他方はシアンに非感受性でサリチルヒドロキサム酸(SHAM)に感受性の呼吸系である。nigerの菌体量は減少するが、菌体量当たりのクエン酸生産量は増大した。シアン非感受性呼吸経路の阻害剤であるSHAMを添加して培養すると、菌体量は変化しないにもかかわらずクエン酸生産量は著しく減少した。これらのことから、シアン非感受性呼吸系はクエン酸生産に大きく貢献する呼吸系であることを明らかにした。oxidaseによって触媒されていることを明らかにした。bpの読み取り枠(ORF)の構造を明らかにした。anomala由来のものとはアミノ酸レベルでそれぞれ50%、52%の相同性を示す。当該遺伝子のORFを大腸菌用の発現ベクターpkk223-3にサブクローニングして大腸菌に導入すると、形質転換体はシアン非感受性でSHAMに感受性の呼吸を獲得した。親株と比較して、菌体増殖にはほとんど変化がないにもかかわらずクエン酸生産量が大きく減少することを明らかにした。最適な講義方法の選択2000年-概要:受講人数あるいは使用教室などの規模に応じて、最良の教育効果が上がるように講義方法を変えている。プリント配布とパワーポイントの併用および試問(200名以上の教室)、板書とプリントの併用および試問(100-150名)、板書と教科書および質疑応答(50-100名)、教科書を使用したゼミナール形式と個別の口頭試問(20名以下)、など最適な講義方法を考えて実施している。講義内容には最新かつ身近な事例を盛り込むようにしている。概要:アンケートなどによる授業評価については毎年度検討し、講義方法あるいは講義内容がより良いものになるように取り組んでいる。