Achievements本研究ではミトコンドリアのADP/ATP輸送体に注目し、その特異的阻害剤の1つであるボンクレキン酸との相互作用の様式を明らかにするために、ボンクレキン酸と相互作用しているアミノ酸残基の同定を目的とした研究を行う。cloningの2つの技術を併用した高効率な機能復帰変異株の獲得技術を用いて、ランダムにアミノ酸変異を導入したADP/ATP輸送体のライブラリーの中から、ボンクレキン酸存在下でもヌクレオチド輸送活性を示す復帰変異株の取得を進めることを計画している。初年度の実験で、復帰変異株のスクリーニングに至適な実験条件を特定することができたので、H30年度には実際にボンクレキン酸存在下で生育できる復帰変異株の獲得を進めた。Zemanらによる先行研究によって、G30S、Y97C、L142S、G298Sの4つの点変異がボンクレキン酸耐性をもたらすことが報告されていたが、我々の研究で、L142SとG298Sの2つの変異を再現することができた。I200V、S245P、V301Iという3つの新たな変異を特定することに成功した。これらのいずれの点変異を導入したADP/ATP輸送体も、野生型の輸送体が機能できなくなる0.2μMのボンクレキン酸存在下でもヌクレオチド輸送活性を示すことができることが明らかになり、これらのアミノ酸残基が実際にボンクレキン酸と相互作用していることを明らかにすることができた。planned.Reasonすでに報告のあった4つの変異のうち、2つの変異(L142SとG298S)を再現できたのは驚きであった。変異する先のアミノ酸、すなわちこの2つの変異についてはSerが全くぶれることなく再現できたことは、他のアミノ酸への置換では耐性の獲得につながらないことを意味している。新たに3つの点変異(I200V、S245P、V301I)を特定できたこと、またこれらのアミノ酸の点変異が実際にボンクレキン酸耐性をもたらすことを検証できたことは特筆に値する進捗である。Activityこれまでの研究で、ADP/ATP輸送体の7つのアミノ酸残基がボンクレキン酸と相互作用していることが明らかになった。ボンクレキン酸のADP/ATP輸送体との解離定数は10-8M程度であることが知られいるため、まだ未同定のアミノ酸残基がボンクレキン酸と相互作用している可能性が考えられるので、引き続きこれらの探索研究を進める。同定されたアミノ酸残基がボンクレキン酸との相互作用にどの程度寄与しているのかを明らかにするための実験にも着手したい。