入力中の回答があります。ページを離れますか?※ページを離れると、回答が消えてしまいますページを離れるA回答を続ける入力中のお礼があります。11:19回答数:2件DNA断片をPCRで増幅し、電気泳動で検出する実験なのですが、「泳動バンドとして目に見えるほどまでは増えなかったサンプルでは、PCR反応中に何が起こっているか」という問いで、考えてもわかりません。どなたか教えてください。通報するこの質問への回答は締め切られました。14:12解釈しにくいのですが、増幅しなかった原因も含めるかと思いました。アニール温度が適切でないため)、DNA断片が一本鎖(二本鎖)にならなかった、酵素が働かなかった。(伸長時間が短くて(DNA断片が長すぎて)、)酵素が最後まで増幅できかった。考えられると思います。原因はまだありますが、このようなところだと思います。反応中に起こっていることなので、組成の問題ではありませんね。○機械が途中で止まった○誰かが蓋を開けてしまい、水が蒸発して溶液の濃度が変わった○高次構造をとってしまい、増幅が阻害された○耐熱性ではないポリメラーゼが入っていて、失活した○誰かがチューブにEDTAなどをいれて反応が阻害した○テンプレートの量かサイクル数が少なくて十分に増幅しなかった○テンプレートなどといっしょに持ち込んだプロテアーゼがポリメラーゼを分解したなどは、「泳動バンドとして目に見えるほどまでは増えなかったサンプルでは、PCR反応中に何が起こっているか」の回答になり得ると思います。回答数ランキングです。私は化学系の学科に所属する大学生です。生物化学の学生実験でPCRとゲル電気泳動を行ったんですが、課題の回答がわからず困ってます・・・どなたか教えていただけませんか?(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか?(2)全くバンドが検出されないサンプルもあるが、それはなぜか?(3)mRNAの発現を正確に行うのになぜPCRのサイクル数が重要なのか?(4)電気泳動で検出されたバンドに関して、bpを解析する際にサイズマーカーの位置と比較する以外にどう考察・解析したらいいのか?4つもあってすみません!生物系はほんとに苦手なんです・・どれか1つでもいいので教えてください!あとできれば考察の材料なんかも教えてもらえると嬉しいです・・Aベストアンサー(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか?PCRの原理を見ると理論上2のn乗(n=サイクル数)でPCR産物は増えていきます。そのため25と30サイクルだと2の5乗の違いが出ますただ、実際やってみるとわかるのですが鋳型量が多かったりするといち早くPCRが限界量まで増えてしまうことがありますそれはPCRが進むことでdNTPやプライマーが失われたり、酵素が失活するためです。25サイクルよりも前にプラトーに達するようですと25と30の間に差は大してなくなります。(2)全くバンドが検出されないサンプルもあるが、それはなぜか?一言で言うとPCRがうまくいっていないということですね。プライマー設計が悪い。鋳型の状態が悪い作業的なミス(入れ忘れなど)Tm値などのプログラムミスこういったところでしょうか目的のものがあるか無いかという実験であれば無い(3)mRNAの発現を正確に行うのになぜPCRのサイクル数が重要なのか?mRNAの発現量を観察する場合はほとんどの場合、いったんcDNAに逆転写してその後、そのRT-PCR産物を鋳型として通常のPCRを行います。肝心の目的物の量を測る方法はいくつかあるのですが最も簡単なものはPCRがプラトーに達する前にPCRを止め(20サイクル程度)電気泳動後ゲル染色やサザンブロットによって目的産物量を可視化、定量します。mRNA量が多い=鋳型量が多い=同サイクル数ならより強いシグナルとなるわけです。一つの方法はリアルタイムPCRと呼ばれる方法で検出試薬にサイバーグリーン(2本鎖のみが検出される)を用いて1サイクル進むごとにPCR産物量をシグナルから算出する方法です。「ライトサイクラー」で検索するとその機器がどういうものかわかると思います。これを使って「ある一定量にPCR産物が達するときのサイクル数」を求めます。mRNA量が多い=鋳型が多い=より少ないサイクル数で一定量に達する(4)電気泳動で検出されたバンドに関して、bpを解析する際にサイズマーカーの位置と比較する以外にどう考察・解析したらいいのか?目的のバンド以外があるのか無いかも重要です。PCRの特異性は実験によっては非常に重要になるからです。低分子側にもわっとしたシグナルが多いとプライマー設計やPCR条件がゆるく、プライマーダイマーができているとかいうことも電気泳動像から見ることができますね(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか?PCRの原理を見ると理論上2のn乗(n=サイクル数)でPCR産物は増えていきます。そのため25と30サイクルだと2の5乗の違いが出ますただ、実際やってみるとわかるのですが鋳型量が多かったりするといち早くPCRが限界量まで増えてしまうことがありますそれはPCRが進むことでdNTPやプライマーが失われたり、酵素が失活するためです。25サイクルよりも前にプラトーに達するようですと25と...続きを読む他の回答も見るQ電気泳動でバンドが出ない理由(学生実験)Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。水層をとりだしてisopropannol加える↓ethanol(洗浄)の順で操作を行った後、電気泳動しました。私がやったサンプルはバンドがだいぶ薄くなってしいました。その理由がわからず悩んでおります。予想としては、phenol/chlorophormをいれて遠心をかけて油層と水層にわけたときに、二つの層の間に白い層(タンパク質が含まれているらしい層)があり、水層(プラスミド含)を取り出す際にそれをピペットで吸ってしまったことが原因だったのかな、と思っているのですが、その根拠などもわかりません。どなたかわかる方がいらっしゃいましたら、教えてくださると幸いです。Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。水層をとりだしてisopropannol加える↓ethanol(洗浄)の順で操作を行った後、電気泳動しました。...続きを読むAベストアンサーバンドが薄くても検出されてるなら、学生実験ならまぁOKではないでしょうか。原因としては、エタノール沈澱洗浄の際、プラスミドまで吸ってしまったり、あるいはもともとサンプルに極端にプラスミドが少なかったりしたこと、あるいは上清分離の際にプラスミドあるいはゲノムの層を取る量が少なかったなどが挙げられるのではないでしょうか。電気泳動の際に、希釈でミスしてたりも考えられます。他の回答も見るQ形質転換効率?の求め方プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。公式のようなものはありません。コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。cfu/ugとなります。(p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。公式のようなものはありません。コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。使用...続きを読む他の回答も見るQプライマーダイマーが出てしまいます。PCRがうまくいきません。プライマーダイマーが出てしまいます。鋳型DNAが少ないとできやすいと聞いた事があるのですが、鋳型はあまりたくさんないので、増やす事もままなりません。他に何か良い方法があったら教えて下さい。Taqポリメラーゼを使っています。Startしてもダメでした。プライマーを減らしたりするのは有効でしょうか??Aベストアンサーいちばん確実でシンプルな解決策は、プライマーを変更することだと思います。プライマーダイマーができてしまうということは、自分がデザインした2ヶのプライマーに、相補的な配列があるということです。アニールしてしまうのですから、温度や濃度などのファクターを変更しても、やはりアニールは起きてダイマーをつくりかねません。頑張っても徒労に終わる可能性があるので、相補的な部分をつくらないように、プライマー配列をデザインし直すのが早いと思います。他の回答も見るQPCRの失敗についてPCR後電気泳動したんですが、バンドが出てきません。PCRって失敗することあるんですか?単にプライマーとテンプレートを入れ間違えたんでしょうか?テンプレートの前後にPCRによりタグ(Hisタグ、制限酵素サイト、転写促進配列など)を付けているのですが。仮にテンプレートとプライマーが合っていない場合、テンプレートだけのバンドは出てきそうですが。ないんでしょうか?Aベストアンサー>PCRってちゃんと溶液を混ぜてもできないことあるん>ですか。決まった条件があるのならまずうまく行かないことはありません。試薬やサンプルに問題がある可能性が大です。ちがうPCRマシーンをつかうと条件が変わってくる可能性があるので出ない場合は再検討してみることも考えたほうがいいことがあります。同じメーカで同じモデルでも機械が違うと違うとおっしゃる方もいます。あとうまくいった時に使用したのと同じ種類のポリメラーゼを使ってますよね。それも確認した方がいいかもしれません。逆手にとって、手元に違う種類の酵素があれば使ってみるのも手かもしれません。メーカーが間違ったプライマーを送って来ることがあるという話も聞いたことがあります。本当かどうかよく分かりませんが、メーカーの人に確認してもらうというのも必要なのかもしれません。他の回答も見るQプライマーのことプライマーで「センスとアンチセンス」や「フォワードとリバース」と呼んだりすると思うのですがこの呼び方の定義はなんですか?頭がこんがらがってしまってよく分からなくなってしまいました。Aベストアンサーセンスは2本鎖DNAのうち、m-RNAのテンプレートとして機能するほうの鎖。アンチセンスはセンス鎖と相補性のあるもう一方の鎖。フォワードとリバースはPCRを行い際に、必要ですね。センス鎖とアンチセンス鎖は5'と3'の方向が逆のため、プライマーは逆方向のものを用意する必要がある。人間の毛根からDNA抽出しPCRを行いました。マーカーの分子量の一番多い上のバンドは同様に太く出たのですが、分子量の一番軽い方が線状でなくもやっと霧状に広がっているのですが何故なんでしょうか。実験目的は、どのくらいとれているかというのが問題だそうです。それってマーカーが太ければ沢山取れてることになるんですか?また、DNAのバンドから、これは何のDNAだ。何のタンパク質を作るDNAのバンドだとかって分かるんですか。そもそもマーカーのDNAはもともと長いものなのに、なんでバンドが並んで1本でなく数本出るのですか。質問が多くてすみません。理解できないで困っています。Aベストアンサー>分子量の軽い方のバンドは、分子量の一番多いバンドが綺麗にでたのに、霧状になって広がって(1.58~0.83kbのあたり全体に)でたのでしょうか?人のサンプルは使ったことがないのですが、RNAということはないでしょうか?微生物の場合は500ベース付近にもやっとでるのですがもしかするとひとだと大きいのかもしれない。他の回答も見るQ電気泳動の失敗はじめまして電気泳動の失敗例を探しています。自分のバンドが何故でなかったのか調べてるのですが...分子量マーカーはちゃんとでたのでゲルの問題ではないと思います。出たのは「靄」みたいなので...ーー;実験はアガルースゲルの大腸菌を制限酵素で切断エチシウムブロマイドで色を着け(色ではありませんが)UVで照射し撮影しました。どなたがご存知の方よろしくお願い致します。制限酵素のSTAR活性かもしれません。STAR活性のある制限酵素(EcoRIなど)を過剰に加えたり、反応時間が長すぎたり(オーバーナイトなど)すると、認識部位以外でも切断が起こって、DNAが靄状(スメア)になります。他の回答も見るQエクセルで片対数グラフを作るエクセルで片対数グラフを作る方法を詳しく教えてください。Aベストアンサーグラフの数値軸のところで右クリックして軸の書式設定(O)→目盛(タブ名)で対数目盛を表示する(L)にチェックを入れてください。作った1枚のアガロースゲルを使うレーン分だけ切り分けPCR産物を泳動したのですが、なにもでませんでした。先に使用したサンプルはマーカーもバンドも確認できました。同じゲルで同じマーカーを使用したのに、なぜこんな事になったのでしょう??どなたか教えて頂けないでしょうか?宜しくお願いいたします。全クリア参照履歴を保存しないこのQ&Aを見た人がよく見るQ&A突然PCRがうまくいかなくなりま...プライマーのこと突然PCRがうまくいかなくなりま...プライマーのこと新規登録・ログインgooIDで新規登録・ログインログイン新規登録(無料)人気Q&AランキングデイリーマンスリーリアルタイムPCRでの相対定量法rep-PCRって?大学の実験でPCR法という...4定量PCRのスタンダード作製5DNA電気泳動について6DNAとRNAの違いについて7生物Iを一夜漬けで勉強したい...8DNAポリメラーゼとRNAポリメラーゼ9SDS-PAGEで、ゲルを作製すると...10DNAマーカー11DNA12ブルー・ホワイトコロニーセレ...13染色体がわかりません。Inc.Q質問する(無料)Q&A検索goo検索gooIDで新規登録・ログイン新規登録する(無料)会員の方はこちら外部サービスのアカウントで新規登録・ログインYahoo!で新規登録・ログインGoogleで新規登録・ログインTwitterで新規登録・ログインFacebookで新規登録・ログインdアカウントで新規登録・ログイン※各種外部サービスのアカウントをお持ちの方はこちらから簡単に登録できます。お客様の許可なしに外部サービスに投稿することはございませんのでご安心ください。会員でない方、会員になるとあなたも質問や回答ができるようになります!!親切・丁寧な回答が集まる場30分以内に回答がもらえ回答数は平均3件!匿名(ニックネーム)での投稿なので。