以上であれば尚良い)。キットまたは、バイオラッド社製CHEFゲノムDNAプラグキット、を使って抽出・精製することを推奨。Hi-C受託サービス実施の場合は、組織をお送りいただきます。Guidelines)がありますのでご連絡下さい。シカゴライブラリのリードペアはどのようにスキャフォルドに使用されていますか?HiRiseTMは、ドラフトアセンブリ上に推定される、偽結合箇所を切り離し、シカゴライブラリのリードペアで再結合し、より大きなサイズのスキャフォルド配列を作成することができます。そのために、HiRiseTMはプロジェクトごとに、作製したシカゴライブラリのインサートサイズ分布のモデル式を作ります。このモデル式は、最初にマップした少量シークエンスから作られます。その後、そのモデルの推定値から、どの場所が切り離されどの場所が再結合されるかが決定されます。シカゴライブラリでは、その多くはライブラリの2つのリードペア間距離が短く、長い距離をスパンするライブラリは少ししか存在しません。その結果、HiRiseTMは多数の短いリードペアと少量の長いリードペアを使用して、アセンブリのコンティグまたはスキャフォルドを、向きと順序をそろえてつなぎます。HiRiseTMは、様々な異なる向きと順序をテストして、その中で、想定されるインサートサイズ分布に最も適したスキャフォルド結果を返します。このグラフは典型的なシカゴライブラリのインサート距離の分布を示します。HiRiseTMによって導き出されたコンティグ(またはスキャフォルド)の向きと順番が正しければ正しいほど、2本のコンティグ(またはスキャフォルド)をつなぐリードペアの距離が、このインサート距離の分布モデルに一致するようになります。シカゴライブラリのシークエンスデータを、メイトペアのデータと同じように、一般のデノボアセンブリに使用できますか?シカゴデータを、メイトペアデータと同じように取り扱うのは難しいでしょう。ほとんどのアセンブラーは、メイトペアライブラリのインサート距離の分布が、正規分布を示すことを仮定しているからです。シカゴライブラリのインサート距離分布は、指数分布を示します。HiRiseTMは、このようなシカゴライブラリ特徴的な距離分布に基づいて設計されたアルゴリズムを搭載しています。そのためシカゴライブラリを用いたスキャフォルディングには、HiRiseTMが必要です。Dovetail社で作製したシカゴライブラリのシークエンスデータのほかに、HiRiseTMスキャフォルドに必要なデータは何ですか?HiRiseTMパイプラインへのインプットデータは以下の通りです。HiRiseTM必要最低限以上のドラフトアセンブリ結果。シカゴシークエンスデータ。ショットガン生データ(ご自身でお持ちのお客様のみ)。必須ではありませんが、最後のギャップクロージングに用いられ、このデータがあるとより良い結果が期待できます。複数のサイズのインサート、リード長のデータがある場合、リード長が長いものを使用します。インサートサイズに制限はありません。メイトペアやフォスミド、BACライブラリなどからのシークエンスデータを持っている場合、これらのデータをアセンブリに使用できますか?これら追加データは、現在のところHiRiseTMパイプラインに直接使用しません。これら追加データは、ドラフトアセンブリの結果を良くするかもしれませんので、全体的に見れば、アセンブリに貢献します。オプティカルマッピングデータなどをお持ちの場合、HiRiseTMの後のスキャフォルド配列を改善するのに役に立つ可能性があります。カバレッジの低いBAC-endシークエンスや、RNA-Seqデータなども、最終アセンブリ結果のバリデーションに使えるでしょう。HiRiseTMのインプットデータに必要なドラフトアセンブリは、何か特別な方法で行なう必要がありますか?いいえ。Falconなどの色々なアセンブラーがありますが、これでなければいけないという制限はありません。データタイプについても、ショットガンデータやPacBioデータなど、HiRiseの必要条件に合致すれば制限はありません。最初のドラフトアセンブリの正確さが、次のスキャフォルディングの完成度に影響し、ひいてはアセンブリ全体の精度にも影響しますので、最初のドラフトアセンブリは、正確であればあるほど望ましいです。HiRiseTMへ持ち込むためのドラフトアセンブリの必要最低条件は?HiRiseTMには、ドラフトアセンブリの絶対的な条件はありません。精度の高いドラフトアセンブリから、良い最終アセンブリ結果が作られるのはもちろんのこと、多くの断片に分かれたアセンブリからは、連続性においてあまり改善は見られないかもしれません。具体的な目安として、1)スキャフォルドまたはコンティグのN50が1Mb以上かつN90が20kb以上、2)フローサイトメトリーなどで確認した推定ゲノムサイズの少なくとも75%がドラフトアセンブリに含まれることを推奨します。これらはひとつのガイドラインで、ゲノムの特徴によって大きく変わります。いずれにせよ、HiRiseTM解析を開始する時点で、お客様は、ドラフトアセンブリの状態と、スキャフォルドによる予想結果についてDovetail社とメールあるいはウェブを介しての打ち合わせをすることを推奨します。カバレッジ、2x100bpの場合は90Xカバレッジのデータ量が必要です。性染色体に興味がある場合は気をつけることはありますか?性染色体の配列、性染色体上の遺伝子を特に解析したい場合、単純に2倍のカバレッジが必要になります。ドラフトアセンブリについて、N50は長いがエラーも大きいアセンブリと、エラーは小さいがN50も短いアセンブリがある場合、どちらを優先したら良いですか?一般的には、HiRiseTMの必要条件に合致する限り、N50は短くともエラーが少ない方を優先します。シカゴライブラリはどのようにシークエンスされますか?ライブラリそのものは、どんなシークエンサーでも読むことはできます。シークエンサーを使用しています。シカゴライブラリをシークエンスするために必要な条件は?ペアエンドまたはシングルリードのシークエンスで、最低100bpあることが、HiRiseTMソフトウェアによる解析に必要です。Dovetail社のサービスでは、2x150bpでシークエンスします。長いリード長(例:2x250bp)であれば、フェージングの検出には効果的かもしれませんが、スキャフォルドの長さや質に大きく貢献するわけではありません。HiRiseTMアセンブリに必要なシカゴライブラリデータの条件は?シカゴライブラリの必要データ量は、ゲノムや生物種によって様々です。これに影響を及ぼす要因は以下のものがあります。コンティグの長さと精度シカゴライブラリの配列データは、ゲノム均一に50~100倍の物理カバレッジが必要です。2500レーン)程度です。シカゴライブラリのデータはたくさんあればあるほど、アセンブリ結果が良くなるものでしょうか?私たちは現在も、シカゴライブラリのデータ量がアセンブリの結果にどう影響するか、調査していますが、100カバレッジまでで十分な結果を得ています。サンプルに依存しますが、これ以上のデータを増やして改善する場合もあるかもしれません。最終納品物はどのようなものですか?インターネット経由のダウンロード形式にて提供します。ご要望に応じて、日本のお客様向けには、ハードディスクで納品されます。HiRiseTMによるアセンブリ配列(FASTAフォーマット)アセンブリ結果のサマリーレポート(英語)ドラフトアセンブリにて推定されるミスジョイント情報ドラフトアセンブリに対してマップされたシカゴライブラリの位置情報ゲノムアセンブリによって結果が異なるのはなぜでしょうか?ゲノムアセンブリの結果には複数の要因が複雑に関係しますので、結果は様々です。HiRiseTMアセンブリの結果に最も影響が大きいのは、インプットに使われるドラフトアセンブリの精度です。ドラフトアセンブリのコンティグ配列が長く、精度が高いほど、最終結果も良くなります。ドラフトアセンブリのクオリティは、リピートの種類やヘテロ接合性、サイズなど、ゲノムの特徴に大きく依存します。SGAなど)にもアセンブリ結果は影響を受けるでしょう。HiRiseTMアセンブリの結果は、これらの要因に加え、シカゴライブラリの配列データにも左右されます。シカゴデータで特にアセンブリに影響が大きいのは、ライブラリのゲノムカバレッジ均一性、リードペア間の距離の分布、シグナルノイズ比です。これらが最適な値を常に示すようなライブラリ調製を行なっています。シカゴライブラリにおいては、ほとんどの要因はプロトコルで既に最適化されています。どれだけ長くてきれいなDNAを抽出できるかが最も影響が大きくコントロール可能な要因です。アセンブリ結果はどのように評価できますか?プロジェクトとしては稀なケースですが、標準的な参照ゲノム配列がある生物種の場合、アセンブル結果配列を参照配列と比較することでエラーの種類や頻度を算出できます。これまでDovetail社では、HiRiseTMアセンブリの精度を高めるため、ゴールドスタンダードの参照配列がある生物種をシークエンスし、アセンブリ結果を評価し、プロトコルや解析アルゴリズムを最適化してきました。Dovetailアセンブリサービスを頼まれるお客様のほとんどは、参照配列が未知の生物種だと思います。これらのアセンブリ結果を評価するためには、まず対象ゲノムアセンブリ結果と、進化的に近く既知のゲノム配列との間で、シンテニー(染色体上の遺伝子座の並び・順番)を比べます。近縁種で既知のゲノム配列が無い場合、BAC-ends配列やトランスクリプトームデータを利用することもできます。BAC-endデータは数十kbから数百kbに及ぶ長鎖配列です。これらのデータはHiRiseTMアセンブリの結果配列にアラインすることで、予想インサートサイズやリードの向きを精査し、エラー頻度を算出することに用いることができます。アセンブリそのものに使われることはありません。までお問い合わせください。Reserved.特定商取引法に基づく表記プライバシー・ポリシ。