assay(プルダウンアッセイ)を中心に~相互作用タンパク質の特定は、機能未知のタンパク質の働きを知る上で非常に重要な情報です。ここでは、タグ付きタンパク質を利用した相互解析手法について紹介します。GST融合タンパク質を用いたプルダウンアッセイを中心に、相互作用解析の手法を見ていきましょう。タグ付きタンパク質が相互作用解析に相互作用タンパク質の解析にタグ付きタンパク質が有用である理由として、以下の事項が挙げられます。純度を高めることが容易タグ付きタンパク質はアフィニティー精製により、純度の高い目的タンパク質を容易に得ることができます。目的タンパク質の抗体が手元に無い場合にも、タグに対する抗体、もしくは特異的に作用する分子を用いて結合・検出することができます。下記に掲載しているプルダウンアッセイでは担体への結合、ファーウェスタンブロッティングでは検出にこの特長を利用しています。これらの特性からタグ付きタンパク質は相互作用解析に広く用いられています。本報では、下記3種の相互作用解析手法についてご紹介します。(コントロール)図例の場合、GST融合ベイトタンパク質に結合するタンパク質3種類(赤、紫、緑)確認されています。緑で示されるタンパク質はコントロール(GST)にも確認されているため、疑陽性の相互作用タンパク質と判断されます。プルダウンアッセイは、タグ付きタンパク質を使った相互作用タンパク質解析で最も一般的な方法です。担体に固定化したタグ付きタンパク質(ベイト)に任意のサンプルをインキュベートした後に溶出させ、ベイトと相互作用する(結合する)タンパク質との複合体を単離する方法です。インキュベートするサンプル溶液には、細胞抽出液や培養上清、またはベイトとの相互作用が予想される精製タンパク質などを用います。GST融合タンパク質を用いたプルダウンアッセイの実験フローを図1に示しました。プルダウンアッセイをはじめとした相互作用タンパク質解析では、いかに疑陽性タンパク質*を除くかがポイントです。GST融合タンパク質を用いたプルダウンアッセイにおける注意点を以下に挙げておきます。図右のフローはGSTのみを用いたコントロールの解析系を示しており、ここで溶出されたタンパク質は疑陽性として扱います。処理する前のサンプルをあらかじめ担体で処理することも効果があります。4Bにサンプルをインキュベートさせる操作を挟むことで、担体が要因となる疑陽性タンパク質を除去することができます。当然のことですが、不純物は疑陽性結合のタンパク質が増える要因となります。アフィニティー精製だけでは純度が不十分である場合には、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィーなどで純度を十分に高めます。大腸菌でGST融合タンパク質を発現させた際には、いくつかの大腸菌由来タンパク質が担体に結合することが報告されています。これら代表的な不純物の除去方法については、下記リンク先をご参照ください。)をもちますので、相互作用の特性によっては結合が阻害される可能性があります。このケースでは、タグの位置をN末端、またはC末端に入れ替えることで改善される可能性があります。N末端、C末端を入れ替えても改善しない場合では、タグ自体を変えてしまいましょう。His-tag、Strep(II)-tag、Flag-tagなどの低分子タグであれば、立体的な相互作用障害はおきにくくなります。インキュベート時間の検討インキュベートの時間が長すぎると、疑陽性のタンパク質が結合しやすくなります。下記、一般プロトコールの4°C、2時間が標準的ですが、解析対象によってはインキュベート時間を最適化することで信頼性の高い結果を得ることができます。プルダウンアッセイのプロトコール例プルダウンアッセイの一般プロトコールをご紹介します。SpinTrapを用いた例を挙げます。細胞抽出液を用いる場合、一般的に10の6乗~7乗の細胞でサンプル調製を行います。サンプル量については、実験結果を解析後に調節してください。4B)をボルテックスして再懸濁する。カラムのキャップを1/4程度空け、カラム底の封をとる。