チューブに落ちたバッファーは捨て、カラムの底に封をはめる。同様に、コントロールとしてGSTにサンプル溶液を処理したものも用意する。上部のキャップを閉めてからデカンテーションで混合させ、4°Cで2時間インキュベートする。mlチューブに設置する。素通り溶液は保存しておき、必要に応じてSDS-PAGEで検証する。溶出バッファーをカラムに添加し、キャップと封をして5~10分インキュベートする。mlチューブに設置する。遠心分離し、溶出サンプルとする。(ウエストウエスタンブロッティング)ファーウェスタンブロッティングは、メンブレンに転写したタンパク質との相互作用を解析する手法です。ウエストウエスタンブロッティングとも呼ばれています。図2に実験フローを示しました。A)、精製したベイトタンパク質溶液を作用させます。スポットを特定する手法です。精製のしやすさを考えると、タグ付きタンパク質をベイトとして用いる方法はとても有用です。GST融合タンパク質の場合、抗GST抗体がありますので、ベイトそのものの抗体が無くとも抗体検出することができます。対しては特異性の高い抗体がないため、この検出法にはあまり向いていません。標識、または蛍光標識する手法もあります。この場合でも、精製の時点ではタグ付きタンパク質として発現させていることが多いようです。GST融合タンパク質を利用したファーウェスタンブロッティングの実験の流れ細胞抽出液を二次元電気泳動で展開し、メンブレンに転写する。(A)メンブレン上に転写されたタンパク質の変性/リフォールディング処理を行う*ブロッキング処理を行う。ベイトタンパク質溶液とインキュベートする。(B)洗浄操作後、抗GST抗体とインキュベートする。左)ECLによる化学発光など、任意の検出法で検出する。Mグアニジン塩酸を含むTBSTなどの希釈溶液により変性処理を行ったのち、グアニジン塩酸濃度を2倍希釈していく方法が一般的です。それぞれの処理時間はプロトコールにより様々ですが、5~20分程度です。よる解析では結合をリアルタイムで観察できるため、得られる情報は単なる結合タンパク質の同定にはとどまりません。結合の強さ、特異性、カイネティクス(結合の速度論的な解析)など多くの有用な情報を得ることができます。上記手法では特定が難しい弱い相互作用をもつタンパク質の単離も可能となります。上記の手法で特定された相互作用タンパク質との関連を、深く解析することにも役立ちます。抗体を用いることでGST融合タンパク質を結合させたセンサーチップも簡単に用意できます。詳しくはビアコアホームページをご覧ください。purification:タンデムアフィニティー精製)は、2種類のアフィニティータグを用いて精製純度を高める方法です。由来のタンパク質複合体解析例です。~MBP融合タンパク質、Strep(II)-tagタンパク質~MBP融合タンパク質とStrep(II)-tagタンパク質の特性を中心に、末尾にGST融合タンパク質とHis-tagタンパク質を含めた一覧比較表が掲載されています。GST融合タンパク質発現・精製、その他His-tagタンパク質発現・精製、その他このコンテンツを読んだ感想をお聞かせください。下からクリックをお願いします。お問合せフォーム※よくあるお問合せとご回答(FAQ)は「こちらで»」ご覧いただけます。※ファイルを添付してのお問合せは、お手数ですが「Tech-JP@ge.comまでメールにて」お問合せください。関する情報の収集・分析及び提供、新製品・新サービスの研究開発等並びに市場調査のために利用します。当社は個人情報を業務委託先に預ける場合がありますが、個人情報の取扱いに関する法令、国が定める指針その他の規範に従い、委託先に対する必要かつ適切な監督を行います。9:00〜12:00、13:00〜17:30)にて承ります。