Japanese)本発明は、リガンドに特異的に応答して蛍光特性が変化するリガンド蛍光センサータンパク質であって、前記リガンド蛍光センサータンパク質は、第1の蛍光タンパク質ドメインと、N末端側リンカーと、リガンド結合ドメインと、C末端側リンカーと、第2の蛍光タンパク質ドメインとを含み、前記リガンド蛍光センサータンパク質に用いられる蛍光タンパク質がβバレル構造を有するものであり、前記第1の蛍光タンパク質ドメインが前記蛍光タンパク質のN末端からβ1~β3のβシート領域と、これに続くαへリックス領域と、β4~β6のβシート領域とを含み、前記第2の蛍光タンパク質ドメインが前記第1の蛍光タンパク質ドメインと同一の前記蛍光タンパク質のβ7~β11のβシート領域を含み、前記N末端側リンカー及び前記C末端側リンカーは、それぞれ独立して1個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドである。Japanese)蛍光生体イメージングとは、生きた組織又は臓器の内部を観察し、そこで生きた細胞及び分子の動態をリアルタイムで解析する新しい研究手法である。近年の光学機器及び蛍光イメージングの技術革新により、様々な組織又は臓器における、多種多様な生命現象に蛍光生体イメージングを適用することで、生きた細胞及び分子の動きを描出することが可能となってきた。蛍光生体イメージングにおいて、細胞内に存在する分子(リガンド)が特異的に結合するレセプターを用いることで、生きた組織又は臓器内のリガンドの動きを検出することができる。具体的には、レセプターとして、例えば、生体内の分子に特異的に結合する抗体若しくは生体内に存在する抗体に対する抗原、特定の酵素に対する基質若しくは特定の基質に対する酵素、又はATP、cAMP、若しくはcGMP等の生体内の分子の結合ドメイン等を備える蛍光センサータンパク質を用いることで、細胞内のリガンドの濃度分布や時間変化(時空間ダイナミクス)を可視化解析できる。蛍光センサータンパク質は、単色型、レシオ型、及びFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)型に大きく分類される。単色型は、各蛍光センサータンパク質について特定される単一波長での蛍光強度がリガンド濃度に応じて変化するタイプである。レシオ型は、各蛍光センサータンパク質ごとに特定される2つの波長での蛍光強度の相対比がリガンド濃度に応じて変化するタイプである。transfer)現象を利用して、リガンド濃度に応じて前者の断片の蛍光強度と後者の断片の蛍光強度との相対比が変化するタイプである。現在まで、単色型(例えば、非特許文献1参照)、FRET型(例えば、非特許文献2参照)、及びレシオ型(例えば、非特許文献3、4参照)のATP蛍光センサータンパク質が報告されている。Japanese)本発明は、リガンド蛍光センサータンパク質とその使用に関する。前記N末端側リンカー及び前記C末端側リンカーは、それぞれ独立して1個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするリガンド蛍光センサータンパク質。前記蛍光タンパク質がBFP、GFP、Citrine、又はmAppleである請求項1に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。前記リガンド蛍光センサータンパク質は、N末端からC末端に向かって、第1の蛍光タンパク質ドメインと、N末端側リンカーと、リガンド結合ドメインと、C末端側リンカーと、第2の蛍光タンパク質ドメインとが、直接この順番にペプチド結合で連結してなるポリペプチドを含む請求項1又は2に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。前記リガンド蛍光センサータンパク質は、2つのリガンド結合ドメインを含み、N末端からC末端に向かって、第1のリガンド結合ドメインと、N末端側リンカーと、第2の蛍光タンパク質ドメインと、第1の蛍光タンパク質ドメインと、C末端側リンカーと、第2のリガンド結合ドメインと、が、直接この順番にペプチド結合で連結してなるポリペプチドを含む請求項1又は2に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。前記第1の蛍光タンパク質ドメインと第2の蛍光タンパク質ドメインとが同一の蛍光タンパク質に由来する請求項1又は2に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。低分子化合物である請求項1~5のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。前記ヌクレオチド若しくはその誘導体が、ATP、cAMP、又はcGMPである請求項6に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。前記タンパク質が抗原又は抗体である請求項6に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。以下の(D1)~(D3)のいずれかのポリペプチドを含む請求項1~8のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記ポリペプチド(D1)と同一の、リガンドへの結合能及び蛍光特性を有するポリペプチド、(D3)配列番号9~14のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記ポリペプチド(D1)と同一の、リガンドへの結合能及び蛍光特性を有するポリペプチド【請求項10】さらに、オルガネラ局在化シグナルペプチドを含む請求項1~9のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。前記オルガネラ局在化シグナルペプチドがミトコンドリア局在化シグナルペプチドである請求項10に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。前記オルガネラ局在化シグナルペプチドが核局在化シグナルペプチドである請求項10に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。【請求項13】さらに、細胞膜透過性ペプチドを含む請求項1~12のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。請求項1~13のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。請求項14に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。請求項1~13のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質を少なくとも1種類含むことを特徴とする細胞。請求項1~13のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも1種類含む染色体を有することを特徴とする細胞。請求項15に記載の発現ベクターを少なくとも1種類含むことを特徴とする細胞。請求項16~18のいずれか一項に記載の細胞を含むことを特徴とする非ヒト生物。請求項1~13のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質、請求項14に記載のポリヌクレオチド、請求項15に記載の発現ベクター、請求項16~18のいずれか一項に記載の細胞、及び請求項19に記載の非ヒト生物からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とするリガンド濃度測定用キット。第2の蛍光タンパク質ドメインは、第1の蛍光タンパク質ドメインと同一の蛍光タンパク質のβ7~β11のβシート領域を含み、ATP結合ドメインはF0F1-ATP合成酵素のεサブユニットからなり、N末端側リンカー及びC末端側リンカーは、それぞれ、1個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするATP蛍光センサータンパク質。Rポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを含む請求項24に記載のATP蛍光センサータンパク質。Rポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを含む請求項24又は25に記載のATP蛍光センサータンパク質。前記ATP蛍光センサータンパク質は、第1及び第2の蛍光タンパク質ドメインの対の異なる少なくとも2種類のATP蛍光センサータンパク質である請求項28に記載の蛍光組成物。