Iに分類される受容体であり、それぞれPAQR1、PAQR2とも称される。Iに分類されるPAQR3は、AdipoR1及びAdipoR2と同様にアディポネクチンと結合することから、アディポネクチン受容体3(AdipoR3)とも称される。Iに分類されるPAQR4をアディポネクチン受容体4(AdipoR4)と定義する。スクリーニング方法を提供することができる。-/-マウス及び野生型マウスにおける変形性関節症の発症率を示すグラフである。足首関節の組織切片の病理組織診断結果を示す図である。-/-マウス及び野生型マウスの新生児の初代軟骨細胞における軟骨形成を示すグラフである。-/-マウスの初代軟骨細胞を各種濃度の組換えヒトCTRP6の存在下で培養したときの軟骨形成を示すグラフである。ATDC5細胞を各種濃度の組換えヒトCTRP6の存在下で培養したときの細胞数を示すグラフである。ATDC5細胞を組換えヒトCTRP6の存在下で培養したときの、MAPK及びリン酸化MAPKのウェスタンブロット結果を示す図である。ATDC5細胞を組換えヒトCTRP6の存在下又は非存在下、且つ、MAPK阻害剤の存在下で培養したときの細胞数を示すグラフである。siRNA、又はコントロールsiRNA-1を導入したATDC5細胞を、組換えヒトCTRP6の存在下又は非存在下で培養したときの細胞数を示すグラフである。siRNA、又はコントロールsiRNA-2を導入したATDC5細胞を、組換えヒトCTRP6の存在下又は非存在下で培養したときの細胞数を示すグラフである。siRNA、又はコントロールsiRNA-1を導入したATDC5細胞を組換えヒトCTRP6の存在下で培養したときの、ERK及びp-ERKのウェスタンブロット結果を示す図である。siRNA、又はコントロールsiRNA-2を導入したATDC5細胞を組換えヒトCTRP6の存在下で培養したときの、ERK及びp-ERKのウェスタンブロット結果を示す図である。ATDC5細胞を組換えヒトCTRP6の存在下又は非存在下、且つ、AdipoR1ブロッカーの存在下又は非存在下で培養したときの細胞数を示すグラフである。ATDC5細胞をアディポネクチンの存在下又は非存在下、且つ、AdipoR1ブロッカーの存在下又は非存在下で培養したときの細胞数を示すグラフである。ATDC5細胞をAdipoRonの存在下又は非存在下、且つ、AdipoR1ブロッカーの存在下又は非存在下で培養したときの細胞数を示すグラフである。ATDC5細胞を組換えヒトCTRP3の存在下又は非存在下、且つ、AdipoR1ブロッカーの存在下又は非存在下で培養したときの細胞数を示すグラフである。siRNA、又はコントロールsiRNA-1を導入したATDC5細胞を、組換えヒトCTRP3の存在下又は非存在下で培養したときの細胞数を示すグラフである。siRNA、又はコントロールsiRNA-2を導入したATDC5細胞を、組換えヒトCTRP3の存在下又は非存在下で培養したときの細胞数を示すグラフである。[0020]以下、本発明の実施形態について説明する。本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。アディポネクチン受容体1(AdipoR1)、アディポネクチン受容体2(AdipoR2)、アディポネクチン受容体3(AdipoR3)、及びアディポネクチン受容体4(AdipoR4)から選択される少なくとも1種の受容体に対するアゴニスト(以下、「特定AdipoRアゴニスト」という。)を有効成分として含有する。[0022]本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、特定AdipoRアゴニストが軟骨細胞に対する増殖促進作用を有することが確認された。本実施形態によれば、軟骨細胞の増殖を促進するための特定AdipoRアゴニストの使用もまた提供される。製造するための特定AdipoRアゴニストの使用もまた提供される。[0023]特定AdipoRアゴニストとしては、AdipoR1、AdipoR2、AdipoR3、及びAdipoR4から選択される少なくとも1種の受容体を活性化し得る物質であれば特に制限されない。特定AdipoRアゴニストは、AdipoR1、AdipoR2、AdipoR3、及びAdipoR4から選択されるいずれか1種の受容体に対する選択的アゴニストであってもよく、いずれか複数種の受容体に対するアゴニストであってもよい。特定AdipoRアゴニストは、AdipoR1、AdipoR2、AdipoR3、及びAdipoR4から選択される少なくとも1種の受容体を活性化し得る限り、その他の受容体を活性化し得るものであってもよい。[0024]特定AdipoRアゴニストの一例としては、アディポネクチン、CTRP3、及びCTRP6から選択される少なくとも1種が挙げられる。protein)ファミリーに属するタンパク質である。本発明者らによる実験の結果、アディポネクチンはAdipoR1の活性化を介して、CTRP3はAdipoR2の活性化を介して、CTRP6はAdipoR1及びAdipoR4の活性化を介して、それぞれ軟骨細胞の増殖促進作用を示すことが明らかとなっている。[0026]アディポネクチン、CTRP3、及びCTRP6の由来は特に制限されず、ヒト由来であってもマウス等の他の動物由来であってもよいが、ヒト由来であることが好ましい。センター(NCBI)のGenBankデータベースに登録されている情報を参照することができる。GenBankデータベースには、ヒトアディポネクチンのアミノ酸配列としてアクセッション番号AK291525等が、ヒトCTRP3のアミノ酸配列としてアクセッション番号AAI12926等が、ヒトCTRP6のアミノ酸配列としてアクセッション番号CAK54433等が、それぞれ登録されている。典型的なアミノ酸配列は以下のとおりである。アミノ酸配列の下線部分は球状ドメイン(gC1qドメイン)を示す。AFSVGRKTALHSGEDFQTLLFERVFVNLDGCFDMATGQFAAPLRGIYFFSLNVHSWNYKETYVHIMHNQKEAVILYAQPSERSIMQSQSVMLDLAYGDRVWVRLFKRQRENAIYSNDFDTYITFSGHLIKAEDD[0030]アディポネクチン、CTRP3、及びCTRP6は、市販品を使用してもよく、遺伝子組換え法又は化学合成法により製造してもよい。動物細胞にアディポネクチン、CTRP3、又はCTRP6をコードする遺伝子を導入し、タンパク質を発現させればよい。ヒトアディポネクチン、ヒトCTRP3、又はヒトCTRP6を製造する場合、立体構造の保持及び翻訳後修飾の観点から、哺乳動物細胞が好ましく用いられる。Boc法、Fmoc法等を単独で又は組み合わせて製造すればよい。[0031]アディポネクチンは、AdipoR1、AdipoR2、AdipoR3、及びAdipoR4から選択される少なくとも1種の受容体を活性化し得る限り、野生型アディポネクチンのアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなる変異型アディポネクチンであってもよい。同様に、CTRP3及びCTRP6は、AdipoR1、AdipoR2、AdipoR3、及びAdipoR4から選択される少なくとも1種の受容体を活性化し得る限り、野生型CTRP3及び野生型CTRP6のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなる変異型CTRP3及び変異型CTRP6であってもよい。[0032]変異型の各アミノ酸配列と野生型の各アミノ酸配列との配列同一性は、例えば、80%以上であってもよく、85%以上であってもよく、90%以上であってもよく、93%以上であってもよく、95%以上であってもよい。ここで、「配列同一性」とは、2つのアミノ酸配列をアラインメントした場合の配列間の一致性を意味し、例えば、BLASTプログラム(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/cgi)を使用して算出することができる。Immunol.,25(10):551-61(2004))。そこで、特定AdipoRアゴニストは、アディポネクチン、CTRP3、又はCTRP6の球状ドメインを構成するペプチドであってもよい。[0034]また、特定AdipoRアゴニストは、アディポネクチン、CTRP3、又はCTRP6の球状ドメインのアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなる変異型の球状ドメインを構成するペプチドであってもよい。このとき、変異型の各アミノ酸配列と野生型の各アミノ酸配列との配列同一性は、例えば、80%以上であってもよく、85%以上であってもよく、90%以上であってもよく、93%以上であってもよく、95%以上であってもよい。[0035]上記の特定AdipoRアゴニストの中で好適なものとしては、例えば、下記(a)~(c)から選択されるものが挙げられる。(a)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。(b)配列番号3で示されるアミノ酸配列のgC1qドメインからなるタンパク質。(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列のgC1qドメインに対して80%以上の配列同一性を有し、且つ、AdipoR1及びAdipoR4から選択される少なくとも1種の受容体に対するアゴニストとして作用するタンパク質。[0036]上記(c)における配列同一性は、85%以上であってもよく、90%以上であってもよく、93%以上であってもよく、95%以上であってもよい。[0037]また、特定AdipoRアゴニストの他の例としては、下記式(1)で表される化合物が挙げられる。下記式(1)で表される化合物は、AdipoR1及びAdipoR2に対するアゴニストであることが知られている(国際公開第2015/046595号を参照)。2、又は以下で示される基:[化4](省略)を示し、nは、0~3の整数を示し、nが2以上の場合、n個のBは同一又は異なっていてもよい。1~4アルキル基である。6~10アリール基であり、より好ましくはフェニル基である。[0041]「ヘテロアリール基」としては、フリル基、チエニル基、オキサゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピラゾリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾオキサジアゾリル基等の5~14員のヘテロアリール基が挙げられ、好ましくは5又は6員のヘテロアリール基であり、より好ましくはフリル基、ピリジル基、及びベンゾフラニル基である。[0042]「アリールオキシ基」におけるアリールとしては、上記アリール基と同様のものが挙げられ、好ましくはフェノキシ基である。[0043]「アリーレン基」としては、上記アリール基の芳香環に結合した1個の水素原子を除いた基が挙げられ、好ましくはフェニレン基及びナフチレン基である。1~4アルコキシ基(メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、n-ブトキシ基、イソブトキシ基、s-ブトキシ基、t-ブトキシ基等)、水酸基などが挙げられる。3~7シクロアルキル基」としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。2~4アルケニル基」としては、ビニル基、プロペニル基等が挙げられる。2~4アルキニル基」としては、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられ、好ましくは2-プロピニル基及び2-ブチニル基である。4~8第3級アルキル基」としては、t-ブチル基、t-ペンチル基、t-ヘキシル基等が挙げられ、好ましくはt-ブチル基である。[0049]Aで示されるアリール基としては、フェニル基が好ましい。Aで示されるヘテロアリール基としては、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ベンゾフラニル基、及びベンゾオキサジアゾリル基が好ましい。Aで示されるアリールオキシ基としては、フェノキシ基が好ましい。1~4アルコキシ基(メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、n-ブトキシ基、イソブトキシ基、s-ブトキシ基、t-ブトキシ基等)、水酸基などが挙げられる。置換アリール基、置換ヘテロアリール基、又は置換アリールオキシ基としては、上記置換基で1~3置換されたアリール基、ヘテロアリール基、又はアリールオキシ基が挙げられる。Aは、より好ましくは、フェニル基又は上記置換基で1~3置換されたフェニル基である。1~4アルキル基(メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、s-ブチル基、t-ブチル基等)が好ましく、メチル基及びエチル基がより好ましい。mは、0又は1であるのが好ましい。2-CONH-である。1~4アルキル基(メチル基、エチル基、n-プロピル基等)が好ましく、rは0又は1であるのが好ましい。3は同一又は異なっていてもよい。[0054]上記式(2)で示される基としては、例えば、以下の基が挙げられる。bは、2であるのが好ましい。3~7シクロアルキル基であり、好ましくはアリール基であり、より好ましくはフェニル基及びナフチル基であり、さらに好ましくはフェニル基である。3~7シクロアルキル基としては、シクロプロピル基及びシクロブチル基が好ましい。[0058]Bは、Zで示される環状基に置換し得る基であり、nが2以上の場合、n個のBは同一又は異なっていてもよい。nは、0~2の整数であるのが好ましい。1~4アルキル基(メチル基、エチル基、n-プロピル基等)、フェニル基、ハロゲン原子又はニトロ基で1又は2置換されたフェニル基、及びピリジル基が好ましい。6がともに水素原子であるのがより好ましい。1~2アルキルが好ましい。1~4アルキル基としては、メトキシエチル基、エトキシエチル基、及びエトキシプロピル基が好ましい。1~7アルキル基としては、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、s-ブチル基、及びt-ブチル基が好ましい。3~7シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、及びシクロペンチル基が好ましい。1~7アルキル基としては、クロロメチル基、ジクロロメチル基、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、及びトリフルオロメチル基が好ましく、トリフルオロメチル基がより好ましい。ヨウ素原子が好ましい。[0063]上記式(1)で表される化合物の中でも、下記(i)~(vii)の化合物が好ましい。b-CO-である化合物。4~8第3級アルキル基である化合物。2-であり、Aがフェニル基である化合物。2-であり、Aがフェニル基である化合物。1が-CO-であり、Aがフェニル基である化合物。1が単結合であり、Aがo-メトキシフェニル基である化合物。3-フェニル基である化合物。[0064]上記(i)の化合物のうち、好適には、下記式(1a)、(1b)で表される化合物が挙げられる。7は同一又は異なっていてもよい。〕[0066]下記式(1a)、(1b)で表される化合物の一例としては、下記式で表される化合物(「AdipoRon」とも称される。[0067][化7](省略)[0068]上記式(1)で表される化合物は、シス体、トランス体等の幾何異性体、d体-、l体-等の光学異性体などの全ての立体異性体を包含し、当該異性体を任意の割合で含む混合物であってもよい。[0069]上記式(1)で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩の形態であってもよい。酸付加塩としては、塩酸、硫酸等の鉱酸との塩;ギ酸、酢酸、クエン酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、マレイン酸等の有機カルボン酸との塩;メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸等のスルホン酸との塩;などが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩;カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩;アンモニウム塩;トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、N,N-ジメチルアニリン、N-メチル-D(-)-グルカミン、N-メチルピペリジン、N-メチルモルホリン、ジエチルアミン、シクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、N-ベンジル-β-フェネチルアミン、1-エフェナミン、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン等の含窒素有機塩基との塩;などが挙げられる。[0070]また、上記式(1)で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物であってもよい。必要に応じて、特定AdipoRアゴニスト以外の成分を含有していてもよい。剤形は特に制限されず、用途に応じて選択することができる。非経口剤;錠剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤等の経口剤;などが挙げられる。軟骨細胞に接触させることを含む。軟骨細胞は、生体内に存在する軟骨細胞であってもよく、採取された軟骨細胞であってもよい。投与することで、生体内における軟骨細胞の増殖を促進することができる。投与することで、軟骨障害を治療することができる。投与することで、軟骨損傷を改善し、軟骨損傷から軟骨変性への進行、さらには二次性の変形性関節症への進行を予防することができる。「治療」には、症状を消失又は軽減させることのほか、症状の進行の度合いを抑制することも含まれる。「予防」には、発症を防ぐことのほか、発症の時期を遅らせることも含まれる。接触させる方法としては、軟骨組織又は軟骨細胞を培養する培地に添加する方法等が挙げられる。添加することで、軟骨細胞の増殖を促進することができる。[0077]例えば、変形性関節症等の軟骨障害を有する患者や軟骨が損傷した患者から軟骨組織又は軟骨細胞を採取して培養し、培養後の軟骨組織又は軟骨細胞を元の患者に移植又は注入することで、軟骨障害や軟骨損傷を治療又は改善することができる。スクリーニング方法は、AdipoR1、AdipoR2、AdipoR3、及びAdipoR4から選択される少なくとも1種の受容体の活性化を指標として候補物質をスクリーニングすることを含む。スクリーニングすることができる。スクリーニング方法としては、例えば、AdipoR4の活性化を指標として候補物質をスクリーニングすることを含むものが好ましい。[0079]AdipoR1、AdipoR2、AdipoR3、及びAdipoR4から選択される少なくとも1種の受容体の活性化を評価する方法は特に制限されず、任意の方法を採用することができる。[0080]以下に実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。***P<0.001)。-/-マウス)を作製し、遺伝子ノックアウトによる影響を確認した。Commun.,6:8483(2015))に従って作製した。野生型(WT)のC57BL/6Jマウスは、日本クレア株式会社から購入した。-/-マウス及び野生型マウス(いずれも12月齢)を準備し、変形性関節症の発症を肉眼により判定した(n=8)。足首関節の組織切片を作製してサフラニンOで染色し、病理組織診断を行った。-/-マウスは変形性関節症を自然発症することが分かる。[0083]<試験例2>試験例2では、軟骨代謝におけるCTRP6の役割を検討した。コラゲナーゼDを含有するDMEMにより酵素消化し、初代軟骨細胞を得た。FCS含有DMEMに懸濁して24ウェルプレートに播種し、37°Cで2時間培養した(いずれもn=3)。FCS含有DMEMを各ウェルあたり500μL添加し、7日間培養を継続した。8GX溶液(Sigma-Aldrich)により染色した。BZ-9000、株式会社キーエンス)で観察し、ImageJソフトウェア(NIH)により蛍光強度を定量化した。-/-マウスでは、野生型マウスに比べて軟骨形成が阻害された。FCS含有DMEMに懸濁して24ウェルプレートに播種し、37°Cで2時間培養した。Bioscience)を含有するDMEMを各ウェルあたり500μL添加し、7日間培養を継続した。8GX溶液(Sigma-Aldrich)により染色した。BZ-9000、株式会社キーエンス)で観察し、ImageJソフトウェア(NIH)により蛍光強度を定量化した。-/-マウスでは、組換えヒトCTRP6の濃度依存的に軟骨形成が促進された。[0088]<試験例3>試験例3では、マウス軟骨細胞株ATDC5を用いてCTRP6の機能解析を行った。Bioscience)の存在下で培養した。F-12培地を用いた。[0090]そして、培養4日後及び7日後に、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。図3Aに示すとおり、組換えヒトCTRP6の添加により、ATDC5細胞の細胞増殖の亢進が確認された。F-12培地を用いて4時間培養した。F-12培地を用いて、1分間、5分間、15分間、又は30分間培養した。Tris-HCl(pH7.5))を用いて細胞を溶解した。SDS-PAGEゲルに泳動し、タンパク質をPVDFメンブレンに転写した。BSA/TBS中、室温にて1時間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体(ウサギモノクローナル抗体)の存在下、室温にて1時間振盪することにより一次抗体反応を行った。Signaling社から購入した。ImmunoResearch、111-035-144、2000倍希釈)の存在下、室温にて1時間振盪することにより二次抗体反応を行った。Healthcare)を用いて可視化した。各バンドの強度は、ImageJソフトウェア(NIH)により定量化した。[0093]ウェスタンブロット結果を図3Bに示す。図3Bに示すとおり、組換えヒトCTRP6の添加により、ERK1/2のリン酸化が亢進した。Bioscience)の存在下又は非存在下で2日間培養した。p38阻害剤(SB239063、Sigma)をさらに添加した(いずれもn=4)。[0095]そして、培養2日後に、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。図3Cに示すとおり、組換えヒトCTRP6の添加により、ATDC5細胞の細胞増殖が亢進したが、ERK1/2阻害剤の添加により、細胞増殖が阻害された。このことから、CTRP6による軟骨細胞増殖は、ERK1/2のリン酸化を介していることが示唆される。[0096]<試験例4>試験例4では、CTRP6の受容体を同定した。F-12培地を用いて24時間培養した。siRNA、又は6pmolのコントロールsiRNA-2を導入(トランスフェクト)し、48時間培養を継続した。RNAiMAX(Invitrogen)を用いた。siRNA、及びコントロールsiRNA-1の塩基配列は以下のとおりである。Bioscience)の存在下又は非存在下で1日間培養した(いずれもn=4)。その後、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。結果を図4A及び図4Bに示す。siRNAを導入したATDC5細胞では、組換えヒトCTRP6を添加しても、細胞増殖の亢進が確認されなかった。このことから、CTRP6は、AdipoR1及びAdipoR4を介して軟骨細胞増殖を制御していることが示唆される。F-12培地を用いて4時間培養した。F-12培地を用いて15分間培養した。Tris-HCl(pH7.5))を用いて細胞を溶解した。試験例3(2)と同様にしてウェスタンブロット解析を行った。[0101]ウェスタンブロット結果を図4C及び図4Dに示す。siRNAを導入したATDC5細胞では、組換えヒトCTRP6を添加しても、ERK1/2のリン酸化が亢進しなかった。このことから、CTRP6は、AdipoR1及びAdipoR4を介して軟骨細胞増殖を制御していることが示唆される。[0102]<試験例5>試験例5では、CTRP6のほかに、アディポネクチン、AdipoRon、及びCTRP3の受容体を同定した。Bioscience)の存在下又は非存在下で、2日間培養した(いずれもn=4)。F-12培地を用いた。Bioscience)を用いて、上記と同様に培養を行った(いずれもn=4)。AdipoRonを用いた場合には、培養期間を1日間とした。[0105]そして、培養後にヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。結果を図5A~図5Dに示す。図5A~図5Dに示すとおり、組換えヒトCTRP6、アディポネクチン、又はAdipoRonの添加により、ATDC5細胞の細胞増殖が亢進したが、AdipoR1ブロッカーの添加により、細胞増殖が阻害された。組換えヒトCTRP6を添加した場合にも、ATDC5細胞の細胞増殖が亢進したが、AdipoR1ブロッカーを添加しても細胞増殖は阻害されなかった。このことから、CTRP6、アディポネクチン、及びAdipoRonは、AdipoR1を介して軟骨細胞増殖を制御していることが示唆される。[0106]<試験例6>試験例6では、CTRP3の受容体を同定した。siRNA、又はコントロールsiRNA-2を導入(トランスフェクト)した。Bioscience)の存在下又は非存在下で2日間培養した(いずれもn=4)。その後、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。結果を図6A及び図6Bに示す。siRNAを導入したATDC5細胞では、組換えヒトCTRP3を添加しても、細胞増殖の亢進が確認されなかった。このことから、CTRP3は、AdipoR2を介して軟骨細胞増殖を制御していることが示唆される。[0109]2018年2月14日に出願された日本出願2018-024297の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。技術規格が参照により取り込まれることが具体的且つ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。上記の特許・技術に関心のある方は、下記問合せ先にご相談下さい。同じキーワードでJ-STORE内を検索することが出来ます。