mAb用プロトコールこのプロトコールは、ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイによる解析用に非変性タンパク質を磁気ビーズで免疫沈降する際にご使用いただけます。水もしくは同等の精製水で調製してください。mLに加え、混ぜ合わせてください。mLに加え、混ぜ合わせてください。Bufferを用意してください。μLに加え、混ぜ合わせてください。μLに加えてください。培地を吸引除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。非変性状態で細胞を回収するために、培地を除去し、氷冷した1×PBSで細胞を1回すすいでください。mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。プレートから細胞をこすり落とし、遠心用チューブに移して氷上に置いてください。氷上で各5秒間、3回超音波処理してください。14,000xg、4°Cで10分間遠心し、新しいチューブに上清を移してください。上清が細胞溶解物です。必要に応じて、溶解物は-80°Cで保存できます。Beadsへのタンパク質の非特異的な結合を減らすために、細胞溶解物の前洗浄をお勧めいたします。試験サンプルとアイソタイプコントロール用に十分な量の溶解物を前洗浄してください。Beadsのストックチューブを緩やかなボルテックスにより懸濁してください。Beadsの前洗浄は使用直前に行ってください。μLを新しいチューブに加えてください。Rackに10-15秒置いてください。溶液が澄んだら上清を慎重に除去してください。μLを加え、緩やかにボルテックスして洗浄してください。Rackに戻してください。溶液が澄んだら上清を慎重に除去してください。洗浄ステップをもう1回繰り返してください。μLを加えてください。細胞溶解物の最適なタンパク質濃度は目的とするタンパク質の発現量によって異なります。mg/mLから検討を始めることをお勧めします。室温で20分間、ローテーションしながらインキュベートしてください。Rackを用いてビーズから溶解物を分離し、前洗浄した溶解物を新しいチューブに移してください。免疫沈降セクションに進んでください。免疫沈降に使用した一次抗体が特異的かどうかを確認するため、適切なアイソタイプコントロールを組み入れることをお勧めします。#5415をお使いください。アイソタイプコントロールは一次抗体サンプルと濃度を揃え、同時に反応させる必要があります。加え、4°Cで一晩、ローテーションしながらインキュベーションして免疫複合体を形成させてください。Beadsを含むチューブに移してください。室温で20分間、ローテーションしながらインキュベートしてください。Rackを用いてビーズを沈殿させてください。μLで5回洗浄してください。洗浄中はサンプルを氷上に置いてください。次の各ステップのうち、適切なステップに進んでください。μLに懸濁し、軽くボルテックスした後、軽く遠心して沈殿させてください。サンプルを95-100°Cで5分間加熱処理してください。Rackを使ってビーズを沈殿させてください。上清を新しいチューブに移してください。(ウェスタンブロッティングのプロトコールを参照してください)。#5127)の使用をお勧めします。#5127)の使用をお勧めします。μLで2回洗浄してください。洗浄は氷上で行ってください。μLに懸濁してください。30°Cで30分間インキュベートしてください。μLで反応を停止し、ボルテックスした後、30秒間遠心してください。リン酸化基質を含む上清を新しいチューブに移してください。サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱処理し、14,000xgで1分間加熱してください。μL)を電気泳動してください。もちまして本サイトを閉鎖させていただきます。登録変更をお願いいたします。