時代設定は1938年。映画の幕開けを飾るのは、初めての冒険に胸躍らせる若きインディ・ジョーンズの姿。月日は流れ、大人になったインディは長らく音信不通だった父、ヘンリー・ジョーンズ博士を探す旅に出かける。聖杯研究の第一人者として知られるヘンリーは、秘宝探しに燃えるナチスに誘拐されてしまったのだった。ベニスではネズミだらけの地下に閉じ込められ、ドイツ上空では複葉機に乗ってナチスの追撃をかわしたインディは、最強の戦車にも勇敢に立ち向かう。ミステリアスなパワーを秘めた聖杯を守るために、インディ親子は手に手をとって決死の冒険に挑むのだった。