【0073】リード粒子がリポソームBを構成成分とする微粒子である場合、リポソームBと前記RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成されるものがリポソームAとなり、その構成から狭義のリポソームと分類され、リード粒子がリポソームBを構成成分とする微粒子以外である場合でも、脂質膜で被覆されているので、広義のリポソームと分類される。本発明において、リード粒子の構成成分もリポソームであることがより好ましい。本発明におけるリード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子は、該リード粒子を製造後または該リード粒子の製造と同時に、該RNAをリード粒子に付着または封入して複合粒子を製造でき、さらに該複合粒子の製造後または複合粒子の製造と同時に、脂質膜で該複合粒子を被覆することリポソームAを製造することができる。被覆層成分を、該被覆層成分が可溶な極性有機溶媒を含む、該複合粒子が溶解せず、該被覆層成分が分散状態で存在することが可能な濃度の液中に分散させる工程および該複合粒子を該被覆層成分で被覆する工程を含む製造方法で製造することができる。本発明の組成物におけるリポソームの好ましい製造方法としては、以下のリード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子を製造する工程(工程1)および該複合粒子を脂質膜で被覆する工程(工程2または工程3)を含む製造方法があげられる。リード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子を製造する工程リード粒子を、例えば水等の溶媒中に分散させ、リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させて混合し、リード粒子に該RNAを付着させる。工程1において、リード粒子の凝集を抑制するために、リード粒子は凝集抑制物質を含有するリード粒子であることが好ましく、凝集抑制物質として前記糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有することがより好ましい。リード粒子が、正電荷をもつものである場合、リード粒子が分散した液中で、該RNAと付着競合剤を共存させ、付着競合剤を該RNAとともにリード粒子に付着させてもよく、さらにリード粒子が凝集抑制物質を含有するリード粒子である場合にも、リード粒子の凝集をより抑制させるために付着競合剤を用いてもよい。リード粒子と前記RNAの組み合わせとしては、複合粒子が極性有機溶媒を含有する液に分散可能となる組み合わせを選択することが好ましく、極性有機溶媒に対しての溶解度が、工程2または3で用いる脂質膜の構成成分よりも低いことがより好ましく、また、該極性有機溶媒を含む液中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する組み合わせを選択することがより好ましい。よる静電的引力により、リード粒子の構成成分に静電的に付着する物質を包含する。付着競合剤としてのアニオン性物質は、アニオン性を呈する物質であるが、アニオン性の基とカチオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、pHや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてアニオン性物質に分類され得る。【0078】アニオン性物質としては、例えば前記のリード粒子の定義で例示したもののうちのアニオン性物質[具体的には、アニオン性脂質、アニオン性界面活性剤(前記と同義)、アニオン性高分子等]、等電点以上の値のpHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド、核酸等があげられ、好ましくはデキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸、デキストランフルオレセインアニオニック等から選ばれる1つ以上の物質があげられる。【0079】アニオン性脂質としては、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等があげられる。アニオン性高分子としては、例えばポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸、デキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。等電点以上の値のpHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以上の値のpHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ヒストン、プロタミン、リボヌクレアーゼ、リゾチーム等があげられる。【0081】アニオン性物質としての核酸としては、例えばDNA、RNA、プラスミド、siRNA、ODN等があげられ、生理活性を示さないものであれば、どのような長さ、配列のものであってもよい。付着競合剤は、リード粒子の構成成分に静電的に付着することが好ましく、リード粒子の構成成分に付着してもリード粒子の構成成分を凝集させるような架橋を形成しない大きさの物質であるか、分子内に付着する部分と、付着に反発してリード粒子の凝集を抑制する部分をもつ物質であることが好ましい。工程1は、より具体的には、例えば凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液を製造する操作および該リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させる操作(例えば該リード粒子が分散した液中に、該RNAを加えて分散または溶解する操作、該リード粒子が分散した液中に、該RNAが分散または溶解した液を加える操作等)を含む製造方法において実施することができる。ここで、リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させる工程により得られる複合粒子としては、具体的には、該カチオン性脂質を含有するリポソームBを構成成分とする微粒子に該RNAが付着して形成される複合粒子、カチオン性脂質を含有する脂質集合体を構成成分とする微粒子に前記RNAが付着して形成される複合粒子、ポリ-L-リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子を構成成分とする微粒子に前記RNAが付着して形成される複合粒子があげられる。リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させる操作が、該RNAが分散または溶解した液に、さらに付着競合剤を含有させて、これを該リード粒子が分散した液中に加える操作であることが好ましく、この場合、該リード粒子に、該RNAと該付着競合剤が共に付着して複合粒子が製造され、該複合粒子の製造中におけるリード粒子の凝集も、製造後における複合粒子の凝集もより抑制されて製造できる。【0083】リード粒子のリード粒子が分散する液に対する割合は、リード粒子に前記RNAが付着できれば特に限定されるものではないが、1μg/mL〜1g/mLであるのが好ましく、0.1〜500mg/mLであるのがより好ましい。複合粒子を脂質膜で被覆する工程(その1)工程1で得られた複合粒子が分散し、かつ脂質膜の構成成分が溶解した極性有機溶媒を含む液(液A)を調製する操作、次いで、液A中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、複合粒子を脂質膜で被覆する操作を含む製造方法によってリポソームAが製造でき、この場合、リポソームAは分散液(液B)の形態で得られる。液Aにおける溶媒は、該脂質膜の構成成分が可溶で、該複合粒子が分散可能な極性有機溶媒の濃度の該極性有機溶媒を含む溶媒であり、液A中の極性有機溶媒の割合を減少させた液Bでは、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能である。よって、選択的に極性有機溶媒を取り除くことで、極性有機溶媒の割合を減少させることができる。溶媒を含む溶媒であり、極性有機溶媒も液Aにおける極性有機溶媒の割合より低ければ含んでいてよい。ハロゲン化炭素、ハロゲン化炭化水素等があげられ、好ましくは水があげられる。液Aおよび液Cは、イオン、緩衝成分等を含んでいてもよい。極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒の組み合わせは、相互に混合可能である組み合わせであるのが好ましく、液Aおよび液B中の溶媒ならびに液Cに対する、複合粒子および脂質膜の構成成分の溶解度等を考慮して選択できる。溶媒に対する溶解度が低いことが好ましい。ここで、複合粒子の溶解度が低いとは、複合粒子に含有されるリード粒子、RNAおよび付着競合剤等の各成分の、溶媒中における溶出性が小さいことであり、各成分の個々の溶解度が高くても各成分間の結合等によって各成分の溶出性が小さくなっていればよい。対して静電的に結合し、液A中の溶媒に対する溶解度が低くなれば、複合粒子中の成分の溶出が抑制され、複合粒子の液A中の溶媒に対する溶解度を低くすることが可能である。リード粒子が正電荷をもつことは、リポソームAの製造において、複合粒子の成分の溶出を抑制し、製造性と歩留まりを向上させる効果も備えている。液Aにおける極性有機溶媒の割合は、脂質膜の構成成分が可溶で、複合粒子が分散可能であるであれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、脂質膜の構成成分の種類等により異なるが、好ましくは30v/v%以上、より好ましくは60〜90v/v%である。液Bにおける極性有機溶媒の割合は、液Aよりも低い濃度で該極性有機溶媒を含み、脂質膜の構成成分が分散可能で、複合粒子も分散可能であれば特に限定されるものではないが、好ましくは50v/v%以下である。構成成分および極性有機溶媒以外の溶媒をいかなる順に加えて液Aを調製する工程でもかまわず、好ましくは、該複合粒子が分散した極性有機溶媒を含む液(液D)を調製し、液D1中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に該脂質膜の構成成分を溶解させた液(液E)を調製し、液Dと液Eを混合して調製する工程があげられる。液Dと液Eを混合して液Aを調製する際には、徐々に混合することが好ましい。複合粒子を脂質膜で被覆する工程(その2)工程1で得られた複合粒子および脂質膜の構成成分を、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む、該複合粒子が溶解せず、該脂質膜の構成成分が分散状態で存在することが可能な濃度の液(液F)中に分散させる操作を含む製造方法でリポソームAが製造でき、この場合、リポソームAは分散液の状態で得られる。液Fにおける溶媒は、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含み、該極性有機溶媒を含む溶媒に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する溶媒である。液Fの調製方法はいかなる形態をも取ることができる。複合粒子の分散液と、脂質膜の構成成分の溶解液または分散液を調製した後、両液を混合して液Fを調製しても、複合粒子または脂質膜の構成成分のどちらか一方の分散液を調製し、その分散液に、固体状態の複合粒子または脂質膜の構成成分の残る一方を加えて分散させて液Fを調製してもよい。複合粒子の分散液と、脂質膜の構成成分の溶解液または分散液を混合する場合には、複合粒子の分散媒は、あらかじめ極性有機溶媒を含んでいてもよく、また被脂質膜の構成成分は溶解していてもまたは分散していてもよく、脂質膜の構成成分の溶媒または分散媒は極性有機溶媒を含む液または極性有機溶媒のみで構成される液でよい。複合粒子または脂質膜の構成成分のどちらか一方の分散液を調製し、該分散液に、固体状態の複合粒子または脂質膜の構成成分の残る一方を加える場合には、該分散液は、極性有機溶媒を含む液である。液Fを調製した後に複合粒子が溶解せず、脂質膜の構成成分が分散している場合には、複合粒子が溶解せず、脂質膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を加えても、有機溶媒を除去または濃度を減少させてもよい。液Fを調製した後に複合粒子は溶解していないが、脂質膜の構成成分が溶解している場合には、複合粒子が溶解せず、脂質膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を除去または濃度を減少させればよい。複合粒子と脂質膜の構成成分をあらかじめ極性有機溶媒以外の溶媒中で混合し、そこに複合粒子が溶解せず、脂質膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を加えてもよく、その場合には、複合粒子および脂質膜の構成成分のそれぞれを極性有機溶媒以外の溶媒中に分散させ、両分散液を混合した後で、極性有機溶媒を加えることでもよく、複合粒子または脂質膜の構成成分のどちらか一方を極性有機溶媒以外の溶媒中に分散させ、その分散液に、固体状態の複合粒子または脂質膜の構成成分の残る一方を加えて分散させた後で、極性有機溶媒を加えることでもよい。複合粒子および脂質膜の構成成分が分散し、極性有機溶媒を含有する液を、複合粒子が脂質膜で被覆されるに充分な時間、静置または混合する操作を含むことが好ましく、複合粒子と脂質膜の構成成分を、極性有機溶媒を含有する液中に分散させた後、静置または混合する時間は、複合粒子および脂質膜の構成成分を、極性有機溶媒を含有する液中に分散させた後に瞬時に終了させるのでなければ制限はないが、脂質膜の構成成分や、極性有機溶媒を含有する液の種類に応じて任意に設定することができ、得られたリポソームAの収率が定常量となる時間を設定することが好ましく、例えば3秒〜30分である。液Fにおける極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば工程2における極性有機溶媒以外の溶媒で例示した物があげられ、好ましくは水があげられる。液Fにおける極性有機溶媒の割合は、複合粒子と、脂質膜の構成成分がともに分散されている条件さえ満たしていれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、脂質膜の構成成分の種類等により異なるが、好ましくは1〜80vol%、より好ましくは10〜60vol%、さらに好ましくは20〜50vol%、最も好ましくは30〜40vol%である。本発明において、脂質膜の構成成分が極性有機溶媒に対して可溶とは、脂質膜の構成成分が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合、可溶化剤等を用いることにより脂質膜の構成成分が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合、脂質膜の構成成分が極性有機溶媒中で凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し得る性質をもつ場合等を包含する。脂質膜の構成成分が分散するとは、脂質膜の構成成分の全部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化している状態、脂質膜の構成成分の一部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が溶解している状態、脂質膜の構成成分の一部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が沈殿している状態等を包含する。脂質膜の構成成分が溶解するとは、脂質膜の構成成分の全部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化している状態を包含しない。本発明において、複合粒子が分散するとは、複合粒子が懸濁または乳濁もしくはエマルジョン化している状態のことであり、複合粒子の一部が懸濁または乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が溶解している状態、複合粒子の一部が乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が沈殿している状態等を包含する。複合粒子が溶解しないとは、前記の複合粒子が分散すると同義である。複合粒子の濃度は、複合粒子を脂質膜で被覆できれば特に限定されるものではないが、1μg/mL〜1g/mLであるのが好ましく、0.1〜500mg/mLであるのがより好ましい。用いられる脂質膜の構成成分の濃度は、複合粒子を被覆できれば特に限定されるものではないが、1μg/mL〜1g/mLであるのが好ましく、0.1〜400mg/mLであるのがより好ましい。【0096】また、本発明におけるリポソームAの大きさは、平均粒子径が300nm以下であるのが好ましく、200nm以下であるのがより好ましく、具体的には、例えば注射可能な大きさであるのが好ましい。物質による修飾を行うこともでき、これらで得られる被覆複合粒子もリポソームAに包含される。Inc),1995年,p.93-102参照]。vivoでほ乳類の細胞に、例えばKLF5遺伝子およびKLF5により転写が活性化される遺伝子の発現を抑制するRNAを導入することができ、KLF5遺伝子およびKLF5により転写が活性化される遺伝子等の発現の抑制ができる。治療剤または予防剤の有効成分として使用することができる。前記RNAの標的遺伝子が腫瘍や炎症に関連する遺伝子や管新生に関連する遺伝子である場合、例えば、腫瘍の治療剤として該組成物を投与することで、腫瘍の治療を行うことや、炎症の治療剤として該組成物を投与することで、炎症の治療を行うことができる。concept)]取得のツールとして使用することもできる。本発明の組成物は、例えば血液成分等の生体成分(例えば血液、消化管等)中での前記RNAの安定化、副作用の低減、腫瘍等の標的臓器への薬剤集積性の増大、経口や経粘膜での薬剤の吸収の改善等を目的とする製剤としても使用できる。非経口投与または経口投与をあげることができ、好ましくは静脈内投与または筋肉内投与をあげることができ、より好ましくは静脈内投与があげられる。静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤があげられ、上述の方法により調製したリポソームAの分散液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該分散液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該分散液、または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトース、グリシン等の賦形剤を加えた分散液を凍結乾燥して使用することもできる。アミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。クエン酸、アスコルビン酸、システイン、EDTA等の抗酸化剤、グリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。グリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。経口用製剤に加工してもよい。構成成分とするリポソームがあげられる。次に、実施例および参考例により、本発明を具体的に説明する。本発明はこれら実施例および参考例に限定されるものではない。cDNAの配列(GenBank登録番号:NM_009769、配列番号41)から、(a)AAではじまる21塩基の配列、(b)GC含量が20〜80%の2つの条件に当てはまる、11個の部分配列を選択した。開始コドン(配列番号41の167〜169番目の配列)より75塩基以上下流の、コード領域(配列番号167〜1507番目の配列)内の配列で、GC含量が40〜60%のものをなるべく選択するようにした。選択した配列の配列番号41における配列の位置、GC含量を第1表に示した。選択した配列の5'端のAAを除いた19塩基の配列のTをUに変えた配列をそれぞれ配列番号1〜11に示した。No.1〜No.11とよぶ)を以下のようにして調製した。No.1〜No.11それぞれのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を第1表に示した(配列番号17〜38)。No.1は、配列番号17および18の配列からなる2本のRNAを、株式会社日本バイオサービスに依頼して化学合成し、アニーリングさせることにより調製した。Kit、アンビオン社製)を利用したインビトロ転写により調製した。インビトロ転写の鋳型作製に用いるDNAは、北海道システム・サイエンス株式会社に化学合成を依頼した。cDNAを、配列の相同性に基づいてアライメントすることにより、マウスで選択された配列と対応するヒトの配列を得た。cDNA上の21塩基の配列および配列番号41におけるその位置と、該マウス配列に対応するヒトcDNA上の21塩基の配列、配列番号42におけるその位置、該ヒト配列から5'端のAAを除いたRNAの配列を表す配列番号を示した。5および6は、非コード領域の配列をもとにしているため、対応するヒト配列は示さなかった。)/蒸留水を30mg/12mg/mLになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた分散液を室温で0.4μmのポリカーボネートメンブランフィルター(ワットマン製)に4回、0.1μmのポリカーボネートメンブランフィルター(ワットマン製)に10回、さらに0.05μmのポリカーボネートメンブランフィルター(ワットマン製)に24回通してリード粒子を調製した。8mg/mL水溶液0.25mLを添加し、エタノール1mLを加えて複合粒子を調製した。得られた複合粒子の分散液に、脂質膜の構成成分のEPC(日本油脂製)/PEG-DSPEを120mg/25mg/mLになるようにエタノールに溶解した溶液0.25mLを添加し、次に蒸留水23mLを徐々に加え、エタノールの濃度が5vol%以下になるよう調整しリポソームを調製した。得られたリポソームの分散液を超遠心(1時間、110,000×g、25°C)し、上清を除去し、生理食塩水を添加して再分散させてリポソーム分散液を得た(PEG-DSPEエタノール溶液)。120重量部に対して50重量部のPEG-DSPEを少量(リポソーム分散液の約1/25容量)のエタノールに溶解した。リポソーム分散液とPEG-DSPEエタノール溶液をそれぞれ70°Cで2分間加熱した。PEG-DSPEエタノール溶液にリポソーム分散液を添加し、混合後、70°Cで2分間の加熱後、水冷し、製剤を得た。製剤は3ロット調製した。No.1〜3および5〜16のそれぞれの複合粒子が得られる。No.1〜3および5〜16のそれぞれの封入されたリポソームが得られる。得られたリポソームについて実施例1と同様の操作をして該siRNANo.1〜3および5〜16のそれぞれの製剤が得られる。C-dTdT-3’、北海道システムサイエンス社)に変え、同様に製剤を得た。製剤は3ロット以上調製した。KLF5-siRNAは、KLF5-mRNAの配列および該配列と相補的な配列を含まないRNAである。No.4(KLF5siRNA)を生理食塩水に溶解し、0.5mg/mL水溶液を調製した。KLF5siRNAを生理食塩水に溶解し、0.5mg/mL水溶液を調製した。mouse、オス、5週齢)の皮下に投与した。LL/2は、その増殖が血管新生の影響を大きく受けることから、血管新生阻害剤のスクリーニングに使用されている。150μg/shot/mouse/dayとした。経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の増殖を測定した。【0118】また、投与10日後にマウスから、腫瘍を摘出し、癌細胞周辺の血管新生を観察すると共に、癌周辺切片を次の方法でCD31免疫染色およびヘマトキシリン・エオジン染色を行って顕微鏡で観察した。【0119】CD31免疫染色メタノール固定した腫瘍をパラフィンで埋包した後、厚さ5μmの切片を作成し、切片を脱パラフィン化後、室温で10分間、0.5%ヤギ血清を添加しブロッキングした。ブロッキング液を吸引後、抗マウスCD31抗体(100倍希釈)[ファーミンゲン(pharmingen)社製]を添加し室温で2時間静置した。PBSで洗浄後、ビオチン付抗ラットIg抗体(200倍希釈)(DAKO社製)を添加し室温で1時間静置した。Laboratories)社製]を添加し室温で30分間静置した。Laboratories)社製]を添加し室温で30分間静置して発色させた。水洗後、ヘマトキシン染色液で後染色し、脱水して、顕微鏡で観察した。【0120】ヘマトキシリン・エオジン染色メタノール固定した腫瘍をパラフィンで埋包した後、厚さ5μmの切片を作成した。切片を脱パラフィン化後、流水で洗浄し、蒸留水を通した。ヘマトキシリン染色液を添加し5分間静置した。水洗し、0.5%塩酸水を添加し分別した。流水で5分間色出し水洗後、蒸留水を通した。エオジン染色液を添加し3分間静置した。95%エタノールで分別、脱水して、顕微鏡で観察した。図1によると、実施例1で得られた製剤を投与した群では、無処理群と比べ、癌細胞の増殖が抑制された。投与10日後の癌細胞周辺の観察において、実施例1で得られた製剤を投与した群では、無処理群と比べ、腫瘍自身の大きさも小さい上、腫瘍中心部が大きく壊死していることが観察された。実施例1で得られた製剤を投与した群のヘマトキシリン・エオジン染色およびCD31免疫染色した腫瘍組織切片の顕微鏡観察において、無処理群と比較して、腫瘍周辺および腫瘍内で観察された血管内皮細胞が減少していることが観察され、実施例1で得られた製剤を投与した群は、血管新生が抑制されていることが明らかであった。【0122】すなわち、抗血管新生効果および癌細胞の増殖が抑制されたことより、本発明の組成物は、例えばKLF5-siRNAをほ乳類に静脈内投与した場合に、効率よく腫瘍近傍に到達することができ、KLF5遺伝子の発現を抑制することが可能であることが明らかとなった。mouse、オス、6週齢、日本クレア)の腋部皮下に投与した。経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定した。腫瘍体積を、腫瘍の長径×(短径)2×1/2で計算し、有意差をTukey-kramer法で検定した。【0125】また、投与10日後にマウスから、腫瘍を摘出し、癌細胞周辺の血管新生を観察すると共に、癌周辺切片を次の方法でCD31免疫染色し、組織切片に見られるCD31構造をカウントした。一つの腫瘍あたり2視野、各5腫瘍をカウントし、その平均を示した。有意差をTukey-kramer法で検定した。腫瘍を摘出し、95%メタノール溶液で固定した後、パラフィンに包埋した。5μm厚にスライスした腫瘍を脱パラフィン後、100倍希釈した抗CD31ポリクローナル抗体(ファーミンジェン社製、米国)室温で120分間作用させた。CD31抗体を洗浄後、200倍希釈したビオチン化抗ラットIgG(ダコ社製、米国)を室温で60分間作用させた。洗浄後、HRP化アビジン(ベクター社製、米国)を室温で30分間作用させた。洗浄後、ジアミノベンジジン(シグマ社製、米国)で発色させた。図2によると、実施例1で得られた製剤を投与した群のみ、有意に腫瘍増殖の抑制効果が見られた。図3によると、実施例1で得られた製剤を投与した群は、新生血管を示すCD31の茶色の構造が少なく、腫瘍の血管新生が阻害されている。mouse、オス、6週齢、日本クレア)の腋部皮下に投与した。50μgのsiRNAを含む製剤(実施例1、比較例1)、50μgのsiRNAを含むsiRNA溶液(比較例2、3)および生理食塩水を、それぞれ投与し、投与36時間後に腫瘍を摘出し、次の方法でmRNA発現量およびKLF5の量を測定した。kit(キアゲン社製)を用い、ジルコニアボールと破砕機(MM300、キアゲン)を用いて溶解した後精製してRNAを取得した。μgのRNAからランダムプライマーで逆転写した。TaqTM(キアゲン社製)と、特異的プライマーを用いて増幅した。このとき、リボソーマル18SRNAプライマーを内部標準として用いた。5′-GGCTTGGCGCCTGTGTGCTTCC-3′。kit(キアゲン社製)を使って定量した。(アンビオン社製、米国)を内部標準物質として標準化した。有意差をTukey-kramer法で検定した。タンパク分解酵素阻害剤)に浸し、ジルコニアボールと破砕機(MM300、キアゲン)を用いて溶解し、遠心上清を取得した。(バイオラッド、米国)を用いて測定した。10μgのタンパクを95°Cで15分間加熱処理し、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。泳動したタンパクはニトロセルロース膜(アマシャム社製、米国)に転写し、ブロッキング処理(5%スキムミルク中で振とう)をした後、1000倍した抗KLF5モノクローナル抗体(協和発酵工業製)中で1時間振とうした。Quant、アマシャム社製)を用いて定量した。一群3匹、KLF5siRNA投与群のみ一群5匹で定量を行った。有意差をTukey-kramer法で検定した。図4によると、実施例1で得られた製剤の投与群のみ、KLF5mRNAの産生抑制が観察された。図5によると、実施例1で得られた製剤の投与群のみ、KLF5の産生抑制が観察された。mouse、オス、5〜6週齢)の腋部皮下に投与した。腫瘍細胞注射2日後から8日後まで、1μgのsiRNAを含むsiRNA溶液(比較例2、比較例3)および生理食塩水を、それぞれ連日、腫瘍に直接投与した。経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定した。腫瘍体積を、腫瘍の長径×(短径)2×1/2で計算し、有意差をTukey-kramer法で検定した。図6によると、比較例1で得られたKLF5siRNA溶液投与群で腫瘍の成長が抑制される傾向が見られたが、有意差は見られなかった。【0133】また、投与10日後にマウスから、腫瘍を摘出し、試験例2と同様に癌周辺切片をCD31免疫染色し、観察した。新生血管を示すCD31に、両群で明らかな差は見られなかった。5’-GCAGGCAUGUUGACUUCAC-dTdT-3’、ダーマコン社または北海道システムサイエンス社)に変え、同様に製剤を得た。製剤は3ロット以上調製した。5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAG-dTdT-3’、ダーマコン社または北海道システムサイエンス社)に変え、同様に製剤を得た。製剤は3ロット以上調製した。GL3-siRNAは、bcl2-mRNAの配列および該配列と相補的な配列を含まないRNAである。比較例5実施例3と同じbcl2-siRNAを生理食塩水に溶解し、0.5mg/mL水溶液を調製した。No.HTB-81)をヌードマウス(BALB/cAJcl-nu、オス、5週齢、日本クレア)の皮下に投与した。mm3に達したヌードマウスを選択し、実施例3で得られた製剤を、尾静脈内投与した。投与は5日間連続して行った後、2日間休薬し、さらに5日間連続投与した。150μg/shot/mouse/dayとした。経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の増殖を測定した。図7によると、実施例3で得られた製剤を投与した群では、無処理群と比べ、癌細胞の増殖が抑制された。No.CRL-1435)をヌードマウス(BALB/cAJcl-nu、オス、6週齢、日本クレア)の皮下に投与した。mm3に達したヌードマウスを選択し、実施例3、比較例4、5で得られた製剤を、尾静脈内投与した。投与は5日間連続して行った後、2日間休薬し、さらに5日間連続投与した。150μg/shot/mouse/dayとした。経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の増殖を測定した。4で得られた製剤および比較例5で得られた溶液を投与した群と比べ、癌細胞の増殖が抑制された。本発明の標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むRNAを封入したリポソームを含有する組成物を、ほ乳類等に投与することにより、該標的遺伝子の発現を抑制することができる。【請求項1】カチオン性脂質を含有するリポソーム、カチオン性脂質を含有する脂質集合体またはカチオン性高分子を含有する高分子と、腫瘍に関連する標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列を含む鎖および該配列と相補的な配列を含む鎖からなり、RNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する二本鎖RNAとを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分は、エタノールに可溶な脂質膜の構成成分であり、該脂質膜は、中性脂質およびポリエチレングリコール化脂質、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコール脂肪酸エステルを構成成分とする、静脈内投与用の組成物。二本鎖RNAが、標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列を含む鎖および該配列と相補的な配列を含む鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にヌクレオチドの1種または複数種のあわせて1〜6個が同一または異なって付加した二本鎖RNAである、請求項1記載の組成物。標的遺伝子が、腫瘍や炎症に関連する遺伝子である、請求項1または2記載の組成物。標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子である、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。【請求項5】mRNAがヒトまたはマウスのmRNAである、請求項1〜4のいずれかに記載の組成物。中性脂質が、リン脂質である、請求項1〜5記載の組成物。【請求項7】エタノールを含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度でエタノールを含む液が存在する、請求項1〜6に記載の組成物。ekouhou.net。