製品判別番号は存在しませんウェスタンブロット解析用の試料調製ウェスタンブロット試料調製はSDS-PAGEの前に行い、ウェスタンブロットの始まりです。試料抽出物は、ホモジナイゼーションおよび超音波処理法や高圧破砕のような機械的破砕によって細胞培養液または組織から調製することができます。その後、溶解バッファーでさらに溶解させ、最大パーセントのタンパク質が抽出されたことを確認します。ウエスタンブロッティング細胞溶解の手順このページには次の内容が含まれます。このページを見ている人はこんなページも見ています。サンプルに適した溶解バッファーを選択してください。プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤を忘れないように注意してください。ウエスタンブロットデータ解析サンプルに適した溶解バッファーを選択してくださいサンプルに適した溶解バッファーを選択することが、ウエスタンブロットの成功への第一歩です。不適切な溶解バッファーを使用すると、目的のタンパク質が完全に抽出できない、またはほとんど抽出できない可能性があります。そのため、目的のタンパク質の発現位置に基づいて、適切な溶解バッファーを選択することは、この問題を回避することができます。溶解バッファーのレシピを詳しく知りたい場合は、「ウエスタンブロット用バッファー/試薬の調製」ページをご覧ください。プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤を忘れないように注意してくださいプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加することにより、サンプル調製中に漏れたプロテアーゼによる消化からタンパク質を保護することができます。実験条件に適した濃度は最適化する必要があります。各レーンのローディング量が均等であることを確保するために、タンパク質濃度の測定は避けられません。タンパク質の生化学的分析は、タンパク質濃度の正確な定量化に依存しています。Lowryアッセイ、Bradfordアッセイ、BCAアッセイ、およびUV分光法など、生化学実験室でタンパク質濃度を測定するにはいくつかの一般的なタンパク質アッセイ法があります。実験条件に応じて、1つのアッセイを行うことによってタンパク質濃度を決定することができます。Laemmli試料緩衝液とも呼ばれる)中に希釈します。この緩衝液にはグリセロールとトラッキングダイ(ブロモフェノールブルー)が含まれます。グリセロールはサンプルがゲルのウェルに容易に沈むのを助けます。トラッキングダイはゲルの底に達し、これは電気泳動の終わりを示します。PAGEゲルにロードする前に、変性を助けるために、サンプルを100°Cで5分間、または70°Cで10分間加熱します。この際、サンプルをすぐにゲルにロードすることも、後で分析するために4°Cまたは-20°Cに放置することができます。冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、穏やかに振盪することにより、組織培養フラスコまたはディッシュ中の細胞を洗浄します。(コツ:組織培養ディッシュを常に氷上に置いてください)。PBSを加え、細胞スクレーパーを使用して細胞を除去します。混合物をマイクロ遠心チューブにピペットします。RPMで5分間遠心分離し、上清を捨てます。氷冷の細胞溶解バッファー180μLを、20μLの新鮮なプロテアーゼ阻害剤カクテルと共に添加します。(コツ:タンパク質の濃度が最終的に十分高くない場合は、より高い割合のプロテアーゼ阻害剤カクテルで手順を繰り返すことをお勧めします)。RPMで10分間回転させて、ライセートを清澄化します。上清(またはタンパク質混合物)を新しいチューブに移し、氷上で保存するか、-20°Cまたは-80°Cで凍結してください。分光光度計を用いてタンパク質の濃度を測定します。"濃度=質量/容量"を使用して、タンパク質抽出物の容量を決定し、各ウェルが50μgであることを確保します。H2O)を用いて各レーンの容量を等しくします。(コツ:推奨される総容量はレーンあたり15μL)。サンプルを100°Cで5分間ドライプレートで加熱します。ウエスタンブロットとは何ですかこのページを見ている人はこんなページも見ています。メッセージをご入力ください。