本発明の免疫原性組成物に含まれるさらに別の好ましいウイルスは、BRSVの375株である。本発明の免疫原性組成物は、追加の活性成分として、例えばBVDVに対する他の免疫原性組成物も含むことができる。99/55366、米国特許第6,060,457号、第6,015,795号、第6,001,613号、第5,593,873号に記載されているものが挙げられる。【0036】さらに、本発明の免疫原ワクチン組成物は、1種類以上の獣医学的に許容される基剤を含むことができる。デキストロース、エタノール、グリセロールなどが挙げられる。等張剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが特に挙げられる。安定剤としては、アルブミンが特に挙げられる。アジュバントとしては、RIBIアジュバント系(リビ社)、ミョウバン、水酸化アルミニウム・ゲル、コレステロール、水中油エマルジョン、油中水エマルジョンなどがあり、具体的には、フロイントの完全アジュバントと不完全アジュバント、ブロック・コポリマー(CytRx社、アトランタ、ジョージア州)、SAF-M(カイロン社、エメリーヴィル、カリフォルニア州)、アンフィジェン(登録商標)アジュバント、サポニン、クイルA、QS-21(ケンブリッジ・バイオテック社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)、GPI-0100(ガレニカ・ファーマシューティカルズ社、バーミンガム、アラバマ州)、他のサポニン分画、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミン・アジュバント、大腸菌からの熱不安定性内毒素(組み換えによるもの、あるいはそれ以外のもの)、コレラ毒素、ムラミル・ジペプチドなどが特に挙げられる。免疫原性組成物はさらに、他の免疫調節剤として、例えばインターロイキン、インターフェロン、他のサイトカインのうちの1つ以上を含むことができる。免疫原性組成物は、ゲンタマイシンとメルチオレートも含むことができる。本発明の状況で役に立つアジュバントと添加物の量ならびに濃度は当業者が容易に決定できるとはいえ、本発明では、約50μg〜約2000μgのアジュバントと、好ましくは約500μg/2mlの用量のワクチン組成物とを含む組成物を考える。本発明の別の好ましい一実施態様では、約1μg/ml〜約60μg/ml(好ましくは約30μg/ml未満)の抗生物質を含むワクチン組成物を考える。本発明の免疫原性組成物は、投与経路に合わせてさまざまな形態にすることができる。一般に約4°Cに維持し、アジュバントとともに、あるいはアジュバントなしで安定化溶液(例えば生理食塩水および/またはヘペス)の中に再構成することができる。本発明の免疫原性組成物を対象となる動物に投与すると、BVDウイルス1型と2型の一方または両方に対する免疫応答を誘導することができる。したがって本発明の別の一実施態様によれば、対象となる動物に本発明による上記の免疫原性組成物を有効な量投与することによってBVD2型ウイルスまたはBVD1型ウイルスと2型ウイルスの組み合わせに対する免疫応答を促進する方法が提供される。“対象となる動物”という表現には、BVDVに感染するあらゆる動物(例えばウシ、ヒツジ、ブタ)が含まれる。cp5960ウイルスがある。BVDVウイルス(このBVDVウイルスは、化学的不活化または培養物中での継代培養によって弱毒化することが好ましい)を含む免疫原性組成物は、筋肉内または皮下という経路を通じて家畜に投与するが、他の投与経路を利用することもできる。いずれかに投与することや、これら経路の組み合わせが挙げられる。免疫化プロトコルは、従来技術でよく知られている手続きを利用して最適化することができる。動物に1回投与すること、あるいは2〜10週間の間隔で2回以上接種することが可能である。動物の年齢に応じ、免疫原性組成物またはワクチン組成物を再投与することができる。本発明では、BVDV1型と2型によって起こる感染から胎仔を保護するため、生後6ヶ月になる前の健康な家畜にワクチン接種を行ない、生後6ヶ月の時点でワクチンの再接種を行なうことを考える。本発明の別の実施態様では、交配の約5週間前に家畜にワクチンを接種し、交配の約2週間前に再度ワクチンを接種することを考える。半年ごとに混合ワクチンを1回再接種して胎仔がBVDVに感染しないようにすることも考えられる。家畜に誘導される免疫応答の程度と性質は、さまざまな方法で評価することができる。接種した動物から血清を回収し、BVDVウイルスに対して特異的な抗体の存在を、例えば一般的なウイルス中和アッセイによって調べるとよい。【0042】この明細書では、“家畜”という用語はウシを意味するが、その中には、去勢した雄牛、去勢していない雄牛、乳牛、子牛が含まれる。この明細書で用いる家畜は、妊娠しているウシと授乳しているウシを意味する。本発明の方法は、ヒトでない動物(好ましくは授乳している乳牛、妊娠している乳牛とその胎仔)に適用することが好ましい。“治療に有効な量”または“有効な量”という表現は、混合ワクチンを投与する動物に免疫応答を誘導するのに十分な混合ワクチンの量を意味する。免疫応答には、細胞免疫および/または体液性免疫の誘導が含まれるが、それだけには限られない。治療に有効なワクチンの量は、用いる具体的なウイルスが何であるか、および/または家畜の状態、および/または感染の程度によって異なっており、獣医が決定することができる。本発明の方法で使用する不活化し修飾した生ワクチンは、従来技術で知られているさまざまな方法を利用して調製することができる。BVDV単離物は、例えば感染した乳牛の子宮から公知の方法を利用して直接得ることができる。【0045】BVDV単離物は、公知のさまざまな方法を利用して不活化することができる。米国特許第5,565,205号に記載されているように細菌単離物を両性エチレンイミン(BEI)で処理する方法や、ホルマリン、グルタルアルデヒド、熱、光照射、BPL、または公知の他の不活化剤を利用して不活化する方法がある。【0046】ワクチン生成物は、不活化したウイルス単離物に加え、一般的に使用されている1種類以上のアジュバントも適量を含むことができる。適切なアジュバントとしては、無機ゲル(例えば水酸化アルミニウム);界面活性物質(例えばリゾレクチン);グリコシド(例えばクイルAやGPI-0100などのサポニン誘導体);プルロニック・ポリオール;ポリアニオン;非イオン性ブロック・ポリマー(例えばプルロニックF-127(B.A.S.F.社、米国));ペプチド;鉱油(例えばモンタニドISA-50(セピック社、パリ、フランス))、カルボポール、アンフィジェン、アンフィジェン・マークII(ハイドロニクス社、米国)、アルヒドロゲル、油性エマルジョン(例えば鉱油(バイヨールF/アルラセルAなど)と水のエマルジョン、または植物油と水と乳化剤(レシチンなど)のエマルジョン);ミョウバン;ウシのサイトカイン;コレステロール;アジュバントの組み合わせなどが挙げられる。好ましい一実施態様では、サポニンを含む水中油エマルジョンを一般に微流体化する。本発明のワクチンと方法で使用するのが特に好ましいBVDV1型の供給源は、BVDV5960株(国立動物疾患センター(NADC)、USDA、エイムズ、アイオワ州から入手)を含むプレグシュア(登録商標)(ファイザー社)である。PTA-4859、グウェルフ大学、グウェルフ、オンタリオ州から入手)を含むプレグシュア(登録商標)(ファイザー社)である。【0048】5960株と53637株は、BEIを用いて不活化し、市販のアジュバント(好ましくはクイルA-コレステロール-アンフィジェン(ハイドロニクス社、米国))をアジュバントとして用いることが好ましい。本発明による免疫原ワクチン組成物の好ましい用量は約2.0mlである。保存剤が本発明の方法と組成物に含まれていてもよい。本発明で考慮する保存剤としては、ゲンタマイシンとメルチオレートが挙げられる。基剤も添加することができる。基剤は、PBSであることが好ましい。有毒な株を培養物の中で継代培養して弱毒化することによって修飾した生ワクチンを調製する方法は公知である。不活化したBVDV単離物は、以下に示す細菌やウイルスと組み合わせることもできる:ウシ・ヘルペス・ウイルス1型(BHV-1)、ウシ呼吸器多核体ウイルス(BRSV)、パラインフルエンザ・ウイルス(PI3)、カンピロバクター・フィタス、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリッポティフォーサ、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ・ハージョ-プラジトゥノ、レプトスピラ・イクテロヘモルハジア、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ・ハージョ-ボビス、レプトスピラ・インターロガンス・ポモナなどである。本発明によれば、家畜(例えば妊娠している乳牛や、子牛に授乳している妊娠中の乳牛)に投与する混合ワクチンの有効な量により、ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス(1型と2型)に伴う疾患と胎仔の感染に対する効果的な免疫が提供される。一実施態様では、混合ワクチンを約3〜4週間の間隔を空けて子牛に2回投与する。動物の年齢が約1ヶ月〜約3ヶ月のときに第1回目の投与を行なう。第2回目の投与は、混合ワクチンを最初に投与してから約1〜約4週間後に行なう。好ましい一実施態様では、動物を交配させる約5週間前に最初の投与を行なう。2回目の投与は、交配の約2週間前に行なう。その後のワクチン投与は、毎年行なうことが好ましい。別の好ましい一実施態様では、約6ヶ月未満の年齢のときにワクチンを接種した動物は、年齢が6ヶ月を過ぎた後に再度ワクチンを接種する必要がある。その後のワクチンの投与は、毎年行なうことが好ましい。混合ワクチンの有効な量は、ワクチンの成分と投与スケジュールによって異なる。一般に、不活化したウシ・ウイルス性下痢症ウイルス調製物をワクチンに使用する場合には、単位用量のBVDV(1型と2型)当たり約103〜約1010個(好ましくは約105〜約108個)のコロニー形成単位を含むワクチンの量が、約3〜4週間の期間に動物に2回投与する場合に効果的である。効果的な免疫を提供する混合ワクチンは、約3〜4週間の期間に動物に2回投与する場合に、単位用量のBVDV(1型と2型)当たり約105〜108(好ましくは106)個のコロニー形成単位を含んでいる。第1回目の投与は、動物を交配させる約5週間前に行なう。2回目の投与は、交配の約2週間前に行なう。その後のワクチンの投与は、毎年行なうことが好ましい。約6ヶ月未満の年齢のときにワクチンを接種した動物は、年齢が6ヶ月を過ぎた後に再度ワクチンを接種する必要がある。その後のワクチンの投与は、毎年行なうことが好ましい。本発明によれば、好ましい製品であるプレグシュア(登録商標)5(ファイザー社)を投与する場合、プレグシュア(登録商標)5は2回投与することが好ましく、それぞれの回に約0.5ml〜約5.0mlの量を投与する。投与量は約1.5ml〜約2.5mlであることが好ましく、約2mlであることがさらに好ましい。好ましい製品であるプレグシュア(登録商標)5-L5またはプレグシュア(登録商標)5-VL5を投与する場合には、プレグシュア(登録商標)5-L5またはプレグシュア(登録商標)5-VL5は2回投与することが好ましく、それぞれの回に約0.5ml〜約10.0mlの量を投与する。投与量は約3ml〜約7mlであることが好ましく、約5mlであることがさらに好ましい。第1回目の投与は、動物を交配させる約5週間前に行なう。2回目の投与は、交配の約2週間前に行なう。その後のワクチンの投与は、毎年行なうことが好ましい。約6ヶ月未満の年齢のときにワクチンを接種した動物は、年齢が6ヶ月を過ぎた後に再度ワクチンを接種する必要がある。その後のワクチンの投与は、毎年行なうことが好ましい。本発明によれば、投与は、公知の経路を通じて行なうことができる。好ましい投与経路は、皮下投与または筋肉内投与である。本発明では、最初に1回だけ投与した後、毎年のように再接種することも考える。このようにすると、感染に対する免疫の発生および/または維持を目的として毎年行なう再接種の前に子牛に追加投与を行なう必要がなくなる。本発明に従って投与する混合ワクチンは、追加成分としてアジュバントなどを含むことができる。そのようなアジュバントとしては、例えば、無機ゲル(例えば水酸化アルミニウム);界面活性物質(例えばコレステロール、リゾレシチン);グリコシド(例えばクイルA、QS-21、GPI-0100などのサポニン誘導体);プルロニック・ポリオール;ポリアニオン;非イオン性ブロック・ポリマー(例えばプルロニックF-127);ペプチド;鉱油(例えばモンタニドISA-50)、カルボポール、アンフィジェン、アルヒドロゲル、油性エマルジョン(例えば鉱油(バイヨールF/アルラセルAなど)と水のエマルジョン、または植物油と水と乳化剤(レシチンなど)のエマルジョン);ミョウバン;ウシのサイトカイン;コレステロール;アジュバントの組み合わせなどが挙げられる。本発明によれば、家畜に有効な量の混合ワクチンを年齢が約3ヶ月のときに投与すると、呼吸器感染症と生殖器疾患に対して効果的な免疫が得られ、流産が少なくなる。未経産雌牛など)に与える方法であって、BVD(1型と2型)、IBR、PI3、BRSV、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリッポティフォーサ、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ・ハージョ-プラジトゥノ、レプトスピラ・イクテロヘモルハジア、レプトスピラ・インターロガンス・ポモナ、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ・ハージョ-ボビス、レプトスピラ・ブラチスラバ、カンピロバクター・フィタスによって起こる感染に対する免疫をその家畜に与えるため、混合ワクチンを少なくとも1回、好ましくは2回、その家畜に投与する操作を含む方法も提供される。好ましい一実施態様では、ワクチンを皮下投与する。別の好ましい一実施態様では、ワクチンを筋肉内投与する。ワクチンの用量には、約2ml〜約7ml(好ましくは約5ml)が含まれており、単位用量のウイルスにつき約103〜約1010個のコロニー形成単位が1mlに含まれている。別の好ましい一実施態様では、ワクチンは約2mlを含んでおり、単位用量のウイルスにつき約103〜約1010個のコロニー形成単位が1mlに含まれている。混合ワクチンは、動物に2回投与することが望ましい。1回は、年齢が約1ヶ月〜約3ヶ月のとき、もう1回はその約1〜4週間後である。本発明では、1回分の用量を半年ごとに再接種し、交配前に再接種することも考える。本発明により、ウシの胎仔を胎仔感染および持続性胎仔感染から保護する方法であって、BVD(1型と2型)、IBR、PI3、BRSV、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリッポティフォーサ、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ・ハージョ-プラジトゥノ、レプトスピラ・イクテロヘモルハジア、レプトスピラ・インターロガンス・ポモナ、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ・ハージョ-ボビス、レプトスピラ・ブラチスラバ、カンピロバクター・フィタスによって起こる感染に対する免疫を胎仔に与えるため、動物に少なくとも1回、好ましくは2回混合ワクチンを投与する操作を含む方法も提供される。混合ワクチンは2回投与することが望ましい。1回目は交配の約5週間前、もう1回は交配の約2週間前に投与する。(例えばこのような動物の流産))を治療または予防することも考える。本発明のいくつかの実施態様を以下の実施例によって説明するが、本発明がこれら実施例に限定されることはない。それぞれのウシは、それぞれの耳に1つずつ付けたタグによって特定した。ウシが耳のタグを紛失した場合には、新しいタグを取り付けた。研究を始める前に、レプトスピラ症、カンピロバクター症(ビブリオ症)、クロストリジウムの感染に対する市販のワクチンをテスト用のウシに接種した。テスト用のウシを担当獣医の監督下に置いた。獣医は、臨床面からウシを毎日観察した。テスト用ワクチンは、感染性ウシ鼻気管炎(IBR)-パラインフルエンザ3(PI3)-呼吸器多核体ウイルス(RSV)に対する修飾した多価の生ワクチンを乾燥させた形態のものであり、不活化した液体BVDVワクチンとアジュバントを用いて再び水和化する(ファイザー社、ニューヨーク、ニューヨーク州)。BVDV成分は、免疫化のための最少量のBVDV1型および2型と、減菌アジュバントを含んでいた。BVDV免疫化抗原の効力は、ワクチン調製物で使用したバルク流体について8回行なった滴定の幾何平均力価(GMT)を計算することによって明らかにした。再水和化後、2mlのIBR-PI3-BRSV-BVDVワクチンを筋肉内(IM)注射または皮下(SC)注射により投与した。乾燥させたIBR-PI3-RSVワクチンを減菌水で再構成したものをプラセボとして利用し、IM注射によって投与した。Campen博士から入手)を攻撃接種剤として用いた。どのようなウイルスであるかは、SNアッセイと逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって確認した。RT-PCR分析の結果は、p125タンパク質と5'非翻訳領域に関してはBVDV2型ヌクレオチド配列が陽性であり、gp53とp80タンパク質に関してはBVDV1型の保存された配列が陰性であった。攻撃接種の直前と直後に行なった2回の滴定により、攻撃接種ウイルスの効力を示すGMTが103.2TCID50/mlであることが明らかになった。攻撃接種のための接種材料は、鼻腔内に4mlの用量を分割して与えた(1つの外鼻孔に2mlずつ)。ウシ細胞培養物におけるウイルス一定・血清減少アッセイにより、BVDV1型と2型に関する血清中和力価を測定した。血清の系列希釈物を、50-300TCID50の細胞変性BVDV1型5960株、あるいはほぼ同量の細胞変性BVDV2型125c株と混合した。BVDVを攻撃接種後(PC)に単離することを試みた。BVDVに対して陽性の細胞培養物を、ヤギの抗BVDVポリクローナル抗体を用いた間接的な免疫蛍光により調べた。Pathol.、第29巻、27-32ページ、1992年)。乳牛からの全血を頚静脈から5〜10mlのサンプルとして採取し、ヘパリンを入れた試験管に入れ、ウイルスの単離に用いる軟層細胞を調製した。局所麻酔下で左脇腹を切開して子宮から吸引することにより、3〜5mlの羊水サンプルを回収した。3つの切片(脳幹/中脳、大脳、小脳)をそれぞれの胎仔から無菌状態で回収した。行なうため、胎仔組織をパラフィン中に埋包し、抗BVDVモノクローナル抗体を含む1:800と1:600の腹水希釈物を用いてテストを2回行なった。攻撃接種後に保護されたことを証明するため、雌親と胎仔でのBVDV2型の感染事象が統計的に有意に減少したことを、接種群(T2とT3)とプラセボ対照群(T1)で比較して明らかにする必要があった。フィッシャーの正確検定を利用し、(1)攻撃接種直後14日間の乳牛のウイルス血症、(2)羊水からのBVDV単離物、(3)自然流産または帝王切開した胎仔組織と胎仔血からのBVDV単離物、(4)BVDVが陽性である胎仔組織の免疫組織化学という事象を比較した。繰り返して測定した結果に対して混合線形モデルを用いることにより、血清中和力価を分析した。分散の分析から得られる最小自乗平均を利用し、幾何平均力価(GMT)を計算した。そのとき、攻撃接種を行なわなかった乳牛のSNデータは除外した。確率の値としてP≦0.05を利用し、統計的有意さを明らかにした。テストした56頭の乳牛をランダムに3つのテスト群に割り当てた。それは、表1に示したIMプラセボ群(T1)、IMワクチン接種群(T2)、SCワクチン接種群(T3)である。ワクチンまたはプラセボを0日目と21日目に乳牛に接種した。どの場合にも、0日目の接種は首の左側に行ない、21日目の接種は首の右側に行なった。【0069】1日目から14日間にわたり、乳牛に酢酸メレンゲストロールを上に載せた餌を与えた。32日目、発情期に合わせてすべての乳牛にIMプロスタグランジンを注射した(ルタライズ、ファルマシア&アップジョン社、カラマズー、ミシガン州)。BVDVが陰性であることを確認した精子を用い、発情期を示した乳牛に人工授精を行なった。100日目、すなわち妊娠後約65日のとき、乳牛の妊娠状態を直腸触診によって調べた。オークランド、ネブラスカ州)に入れて混じり合わせた。119日目、23頭のテスト用乳牛に有毒なBVDVを鼻腔内接種した。BVDVの単離と血清学的アッセイを目的として、血液サンプルを攻撃接種の日と攻撃接種後の8つの日、すなわち119日目、121日目、123日目、125日目、127日目、129日目、133日目、140日目、147日目(PC0日目、2日目、4日目、6日目、8日目、10日目、14日目、21日目、28日目)に回収した。【0070】147日目(攻撃接種後28日目)に左脇腹を切開し、羊水をそれぞれの乳牛から抽出した。サービス学部に属する施設に送って帝王切開した。手術の直前に血液サンプルをそれぞれの乳牛から回収してSNアッセイを行なった。(300〜301日目の)帝王切開後、血液サンプルをそれぞれの胎仔から回収した。次に胎仔を安楽死させ、BVDVを単離するために組織を無菌状態で回収した。自然流産が起こったいくつかのケースでは、流産が検出されたときとその2週間後に血液サンプルを雌親から採取した。対となるその血液サンプルに対して血清学的テストを行ない(ネブラスカ大学獣医学診断センター、リンカーン、ネブラスカ州)、流産した胎仔からのBVDVの単離(ファイザー中央研究所、リンカーン、ネブラスカ州)と胎仔組織の組織病理学的評価(サスカトゥーン獣医学生体診断、サスカトゥーン、SK、カナダ)を行なった。ワクチンを2回投与した間の期間または投与直後に好ましくない事象は観察されなかった。乳牛はすべて、接種前(0日目)にはBVDV1型と2型に関して血清反応が陰性であった。これは、テスト用乳牛が研究開始時にはBVDVに対して免疫学的にナイーブであることを示している。BVDV1型に関するGMT値を表2に示してある。ワクチンを2回投与した後、接種した16頭の乳牛のうちの15頭がセロコンバージョンを起こした。乳牛61(T3群)は、BVDV1型のSN力価が、0日目に<1:2、21日目に1:19、33日目と119日目に<1:2であった。BVDV2型に対するGMT値を表3に示してある。接種したすべての乳牛(乳牛61も含む)は、2回目の接種後にセロコンバージョンを起こした。(乳牛61は、BVDV2型のSN力価が、0日目に<2、21日目に1:19、33日目に<1:2,048、119日目に1:431であった。)交配のとき(32日目〜41日目)、接種した乳牛は(乳牛61を除き)、BVDV1型のSN力価が1:64〜1:13,777の範囲であった。接種した乳牛は、交配時にBVDV2型のSN力価が1:64〜1:6,889の範囲であった。ワクチン接種後のIM群(T2)とSC群(T3)でのGMT値の違いは、攻撃接種前の2回の時期にも攻撃接種後にも統計的に有意ではなかった。プラセボ群(T1)のすべての乳牛は、攻撃接種のとき(119日目)までBVDV1型と2型の両方に対して血清反応が陰性に留まった。これは、この研究が偶発的な曝露によって無効にならなかったことを示している。プラセボのすべての乳牛は、攻撃接種に血清反応した。これは、それぞれの乳牛で生存できる攻撃接種が起こったことを示している。プラセボ群は、BVDV1型に関し、既往性応答が起こったどちらのワクチン群よりもPC-GMTが有意に小さかった(表2、147日目)。プラセボの乳牛は、BVDV2型に関しても、どちらのワクチン群よりもPC-GMTが小さかったが、差は、IM接種群(T2)と比べたときだけ統計的に有意であった。【0073】3つのテスト群で23頭の乳牛が妊娠していることが確認されたため、攻撃接種を行ない、羊水穿刺を行なった(表1)。羊水穿刺(147日目)と帝王切開(300〜301日目)の間に7頭の乳牛が流産した。4頭はT2群からの乳牛であり、3頭はT3群からの乳牛である。交配した3頭の乳牛(1頭はT1プラセボ群からの乳牛、2頭はT3群からの乳牛)が妊娠していないことが、帝王切開のときにわかった。これら3頭の乳牛に関しては、100日目(交配後65日目)に直腸触診によって妊娠していることを確認した。これは、その後に検出されない流産または胎仔の再吸収が起こったことを意味する。妊娠しなかったこれら3頭の乳牛からの胎仔組織は評価に使えなかったため、これらの乳牛は研究から除外した。259日目、プラセボ群(T1)の乳牛67が死んだため、その胎仔を取り出してBVDVを単離した。したがって研究の終了時に、攻撃接種を受けた23頭の乳牛のうちの12頭に対して帝王切開を行なった。帝王切開により得られた12頭の胎仔と流産した7頭の胎仔に加え、死んだ乳牛からの胎仔(合計20頭)をBVDVの単離に関して評価した。【0074】T2群からの乳牛38は、156日目に胎仔を流産した(妊娠123日目、攻撃接種後37日目)。対となる血清サンプルは評価しなかったが、この乳牛38は、攻撃接種後の末梢血と羊水からのBVDVの単離に関して陰性であった。胎仔は著しく自己分解していた。胎仔の組織病理学的評価と細菌学的評価により、絨毛膜と絨毛膜下の結合組織が化膿性炎症になっていることが明らかになった。ブドウ球菌(スタフィロコッカス・ヒクス)を肺、肝臓、胸膜液から単離した。BVDVの単離と免疫組織化学に関して陰性の結果が得られた。これは、胎仔が攻撃接種によって感染しなかったことを示している。【0075】T3群からの3頭の乳牛(番号21、27、40)は、158日目または159日目に流産した(妊娠125〜127日目、攻撃接種後39日目または40日目)。流産を観察していなかったため、回収した胎仔がどの乳牛からのものであるかを特定できなかった。そこで未知の胎仔1、2、3と名づけた。未知の胎仔1はミイラ化しており、組織学的に典型的なネオスポラ症の病変があった。未知の胎仔2は自己分解しており、化膿して壊死した多病巣性の胎盤炎と、炎症性滲出液に混じった多数の球菌が存在していた。内容物、胎盤組織から単離した。未知の胎仔3は浸軟して自己分解していた。3頭の未知の胎仔からのすべての組織で、BVDVの単離と免疫組織化学に関して陰性の結果が得られた。3頭の雌親はすべて、攻撃接種後の末梢血からのBVDVの単離に関して陰性であった。乳牛21と40は、同様に羊水からのBVDVの単離に関して陰性であったが、乳牛27は、羊水サンプルがBVDVの単離に関して陽性であった。雌親からの対となる血清サンプルは評価しなかった。【0076】T2群からの乳牛45は、160日目に胎仔を流産した(妊娠128日目、攻撃接種後40日目)。胎仔が広範に自己分解していることが明らかであった。内容物、胎盤から単離した。多病巣性の血栓症と化膿性脈管炎を伴った胎盤炎が存在していた。胸膜液に関する血清学的アッセイの結果は、IBR、ウシ・ウイルス性下痢症(BVD)、レプトスピラ症に関して陰性であった。すべての胎仔組織でBVDVの単離と免疫組織化学に関して陰性の結果が得られた。【0077】T2群からの乳牛66は、195日目に胎仔を流産した(妊娠160日目、攻撃接種後76日目)。胎盤の粘膜固有層の顕著な化膿性炎症が胎仔の表面から広がっていることが観察された。vulgaris)を培養した。対となる血清サンプルと胸膜液の血清学的結果は、IBR、BVD、レプトスピラ症が病因であることを示していなかった。すべての胎仔組織でBVDVの単離と免疫組織化学に関して陰性の結果が得られた。壊死、強度の好中球性炎症が起こっていることが明らかになった。炎症の病巣からのグラム陰性球杆菌を培養した。対となる血清サンプルと胸膜液の血清学的結果は、IBR、BVD、レプトスピラ症が病因であることを示していなかった。すべての胎仔組織でBVDVの単離と免疫組織化学に関して陰性の結果が得られた。攻撃接種後にT1プラセボ群の乳牛67から採取した末梢血サンプルと羊水において、陽性のBVDV単離物が得られた。すべての胎仔組織でBVDVの単離と免疫組織化学に関して陽性の結果が得られた。この乳牛からのすべての胎仔は、BVDVの単離と免疫組織化学に関して陽性であった。帝王切開によって得られた12頭の胎仔から回収した血液サンプルに関し、BVDV1型と2型に対するSN力価を調べた。プラセボの5頭の乳牛と接種した7頭の乳牛を帝王切開して得たどの胎仔も、BVDV1型と2型に関して血清反応は陽性でなかった。攻撃接種後のウイルス単離結果を表4に示してある。T1プラセボ群の7頭の乳牛はすべて、BVDVウイルス血症になっていた。これは血清学的結果を裏付けるものであり、接種していないそれぞれの乳牛で生き延びる攻撃接種が起こったことを示している。接種したT2群とT3群の合計16頭からの血液サンプルは、攻撃接種後の8つのサンプルのそれぞれにおいて、BVDVウイルス血症に関して陰性であった。接種したT2群とT3群におけるPCウイルス血症と対照におけるPCウイルス血症の差は、統計的に有意であった(P≦0.0001)。接種した12頭のうちの2頭(12.5%)からの羊水はBVDVが陽性であったのに対し、T1プラセボ群の乳牛では7頭のうちの7頭が陽性であった。これは統計的な有意差である(P≦0.0001)。接種したT3群の乳牛27と60からの羊水サンプルは陽性であった。よるとBVDVが陰性であった。接種した14頭のうちの1頭(T3群の乳牛60)(7.1%)からの胎仔組織は、BVDVの単離に関して陽性であった。これをT1プラセボ群からの胎仔6頭中の6頭(100%)でBVDVが単離されたことと比較すると、統計的有意差がある(P≦0.0001)。BVDVの単離結果は、それぞれの胎仔から評価した胎仔組織に関し、すべて陽性かすべて陰性のいずれかであった。免疫組織化学の結果は、接種したT2群とT3群合わせて14頭のうちの1頭(T3群の乳牛60)(7.1%)からの胎仔組織においてBVDVが陽性であった。T1プラセボ群からの胎仔6頭中の6頭(100%)に由来するすべての胎仔組織が、BVDV-免疫組織化学に関して陽性であった。これは、接種群と比べて有意に大きな値である(P≦0.0001)。BVDV-免疫組織化学の結果は、それぞれの胎仔から評価した胎仔組織に関し、すべて陽性かすべて陰性のいずれかであった。表5に、BVDVの単離結果が陽性であった接種した2頭の乳牛に関するウイルス単離源と攻撃接種前のSN力価を示してある。血清学的データは、接種したT3群の乳牛27と60の両方が、接種に免疫応答したことを示している。乳牛27は、攻撃接種時のBVDV2型のSN力価がT3群のGMTよりも小さかったが、差は有意でなかった。染に関して全体として92.9%で効果が得られた(表4)。これは、BVDV-1を用いた胎仔攻撃接種に対する同じワクチンでの以前のテストにおける88.9%という保護効果(接種した18頭中の16頭がBVDVの単離に関して陰性であった)に匹敵していた(実施例2を参照のこと)。どちらの研究でも、接種していないプラセボの乳牛で100%の胎仔感染が起こった。これは、接種した乳牛が激しい免疫の攻撃接種を受けたことを示している。接種した2頭の乳牛(乳牛27と60)の羊水から攻撃接種ウイルスを単離した(表5)。その結果、どちらの乳牛も、攻撃接種後8回の時期のいずれでもウイルス血症に関して陰性であったにもかかわらず、BVDVの感染に関して陽性であると考えられた。乳牛27の流産した胎仔でBVDVを検出することはできなかった。そのためBVDV陰性として報告する必要があった。雌親の体内でBVDV感染プロセスによってこの胎仔が流産することはあり得た。結果を確認するため、2つの方法を利用して乳牛とその胎仔における保護を評価した(乳牛では、ウイルス血症と、羊水からのウイルス単離、胎仔では、免疫組織化学と、組織培養物中でのウイルスの単離)。控えめな結果を利用し、保護率を決定した。したがって接種した乳牛での保護率は、ウイルス血症に関して陰性である100%ではなく、羊水からのウイルス単離に関して陰性である乳牛の割合の87.5%(14/16)であるとした。BVDVによる攻撃接種を行なう免疫研究に関し、接種していない対照で胎仔の感染が100%になった攻撃接種に対して接種した場合に胎仔が100%保護されたケースは報告されていない。妊娠した乳牛で評価することが一般的でない修飾した生ウイルス(MLV)ワクチンでも、1回の研究における胎仔のBVDV-1感染に対する保護率は83%を超えなかった。Res.、第59巻、1409-1413ページ、1998年。生殖年齢になった健康でBVDV血清反応陰性(すなわち血清中和[SN]力価が<1:2)の59頭の乳牛と未経産雌牛を複数の供給源から取得し、研究期間中、ネブラスカにある研究用施設に隔離した。それぞれのウシは、それぞれの耳に1つずつ付けたタグによって特定した。ウシが耳のタグを紛失した場合には、新しいタグを取り付けた。研究を始める前に、レプトスピラ症、カンピロバクター症(ビブリオ症)、クロストリジウムの感染に対する市販のワクチンをテスト用のウシに接種した。テスト用のウシを担当獣医の監督下に置いた。獣医は、臨床面からウシを毎日観察した。テスト用ワクチンは、感染性ウシ鼻気管炎(IBR)-パラインフルエンザ3(PI3)-呼吸器多核体ウイルス(RSV)に対する修飾した多価の生ワクチンを乾燥させた形態のものであり、不活化した液体BVDVワクチン(キャトルマスター/プレグシュア5、ファイザー社、ニューヨーク、ニューヨーク州)を用いて再び水和化する。このBVDV成分を減菌アジュバントと混合した。BVDV免疫化抗原の効力は、ワクチン調製物で使用したバルク流体について8回行なった滴定の幾何平均力価(GMT)を計算することによって明らかにした。再水和化後、2mlのIBR-PI3-BRSV-BVDVワクチンを筋肉内(IM)注射または皮下(SC)注射により投与した。乾燥させたIBR-PI3-RSVワクチンを減菌水で再構成したものをプラセボとして利用した。Dubovi博士から入手)を攻撃接種剤として用いた。どのようなウイルスであるかは、SNアッセイと逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって確認した。RT-PCR分析の結果は、gp53およびp80タンパク質と5'非翻訳領域に関してはBVDV1型ヌクレオチド配列が陽性であり、p125タンパク質に関してはBVDV2型の配列が陰性であった。攻撃接種の直前と直後に行なった2回の滴定により、攻撃接種・ウイルスの効力を示すGMTが104.3TCID50/mlであることが明らかになった。攻撃接種のための接種は、鼻腔内に4mlの用量を分割して与えた(1つの外鼻孔に2mlずつ)。ウシ細胞培養物におけるウイルス一定・血清減少アッセイにより、BVDV1型と2型に関する血清中和力価を測定した。血清の系列希釈物を、50-300TCID50の細胞変性BVDV1型5960株、あるいはほぼ同量の細胞変性BVDV2型125c株と混合した。BVDVを攻撃接種後に単離することを試みた。BVDVに対して陽性の細胞培養物を、ヤギの抗BVDVポリクローナル抗体を用いた間接的な免疫蛍光により調べた。Pathol.、第29巻、27〜32ページ、1992年)。乳牛からの全血を頚静脈から5〜10mlのサンプルとして採取し、ヘパリンを入れた試験管に入れ、ウイルスの単離に用いる軟層細胞を調製した。局所麻酔下で左脇腹を切開して子宮から吸引することにより、3〜5mlの羊水サンプルを回収した。帝王切開または自然流産の後、目、脳の3つの切片、脾臓、胸腺をそれぞれの胎仔から無菌状態で回収した。行なうため、胎仔組織をパラフィン中に埋包し、抗BVDVモノクローナル抗体を含む1:800と1:600の腹水希釈物を用いてテストを2回行なった。攻撃接種後に保護されたことを証明するため、雌親と胎仔でのBVDV2型の感染事象が統計的に有意に減少したことを、接種群(T2とT3)とプラセボ対照群(T1)で比較して明らかにする必要があった。免疫組織化学という事象を比較した。繰り返して測定した結果に対して混合線形モデルを用いることにより、血清中和力価を分析した。分散の分析から得られる最小自乗平均を利用し、幾何平均力価(GMT)を計算した。そのとき、攻撃接種を行なわなかった乳牛のSNデータは除外した。確率の値としてP≦0.05を利用し、統計的有意さを明らかにした。−テストした59頭の乳牛をランダムに3つのテスト群に割り当てた。それは、表6に示したIMプラセボ群(T1)、IM接種群(T2)、SC接種群(T3)である。ワクチンまたはプラセボを0日目と21日目に乳牛に接種した。どの場合にも、0日目の接種は首の左側に行ない、21日目の接種は首の右側に行なった。【0101】32日目、発情期に合わせてすべての乳牛にプロスタグランジンを筋肉内注射した(ルタライズ、ファルマシア&アップジョン社、カラマズー、ミシガン州)。BVDVが陰性であることを確認した精子を用い、発情期を示した乳牛に人工授精を行なった。96日目、すなわち妊娠後約60日目のとき、乳牛の妊娠状態を直腸触診によって調べた。オークランド、ネブラスカ州)に入れて混じり合わせた。117日目、30頭のテスト用乳牛に有毒なBVDVを鼻腔内接種した。119日目、121日目、123日目、125日目、127日目、131日目、138日目、145日目に回収した。【0102】145日目(攻撃接種後28日目)に左脇腹を切開し、羊水をそれぞれの乳牛から抽出した。サービス学部に属する施設に送って帝王切開した。手術の直前に血液サンプルをそれぞれの乳牛から回収してSNアッセイを行なった。(298〜300日目の)帝王切開後、血液サンプルをそれぞれの胎仔から回収した。次に胎仔を安楽死させ、BVDVを単離するために組織を無菌状態で回収した。自然流産が起こったケースでは、流産が検出されたときとその2週間後に血液サンプルを雌親から採取した。対となるその血液サンプルに対して血清学的テストを行ない(ネブラスカ大学獣医学診断センター、リンカーン、ネブラスカ州)、流産した胎仔からのBVDVの単離(ファイザー中央研究所、リンカーン、ネブラスカ州)と胎仔組織の組織病理学的評価(サスカトゥーン獣医学生体診断、サスカトゥーン、SK、カナダ)を行なった。胎仔保護テストで用いた30頭の乳牛の個々のSN値は、0日目にはBVDV1型と2型に関して陰性であった。これは、テスト用乳牛が研究開始時にはBVDVに対して免疫学的にナイーブであることを示している。GMT値(表7と表8)は、IMワクチン接種(T2群)とSCワクチン接種(T3群)の両方で、2回接種した後に血清反応が誘導されたことを示している。T2群とT3群のすべての乳牛は、2回目のワクチンを投与した後にBVDV1型とBVDV2型に対してセロコンバージョンを起こした(SN力価≧1:8)。交配のとき(34日目〜37日目)、BVDV1型のSN力価は1:27〜1:2,900の範囲であり、BVDV2型のSN力価は1:609〜1:13,777の範囲であった。ワクチン接種後、SC群でのGMT値は、攻撃接種前のそれぞれの時期におけるIM群での値よりもわずかに大きかった。差は統計的に有意ではなかった。攻撃接種後28日目(145日目)、BVDV1型のGMT値(表7)は、IM接種(T2)群よりもSC接種(T3)群のほうが有利であることに関して統計的な有意差を示した。【0105】プラセボ群(T1)のすべての乳牛は、攻撃接種のとき(117日目)までBVDV1型と2型の両方に対して血清反応が陰性に留まった。これは、この研究が偶発的な曝露によって無効にならなかったことを示している。プラセボの乳牛は、攻撃接種に血清反応したが、145日目のBVDV1型と2型に対するGMT応答では、既往性応答が起こったどちらのワクチン群よりもPC-GMTが有意に小さかった(表7と表8)。羊水穿刺(145日目)と帝王切開(298〜300日目)の間に2頭の乳牛が流産した。1頭はT1群からの乳牛であり、もう1頭はT3群からの乳牛である。交配した4頭の乳牛(2頭はT1プラセボ群からの乳牛、1頭はT2群、1頭はT3群からの乳牛)が妊娠していないことが、帝王切開のときにわかった。これら4頭の乳牛に関しては、96日目(交配後60日目)に直腸触診によって妊娠していることを確認した。これは、その後に検出されない流産または胎仔の再吸収が起こったことを意味する。妊娠しなかったこれら4頭の乳牛からの胎仔組織は評価に使えなかったため、これらの乳牛は研究から除外した。したがって研究の終了時に、攻撃接種を受けた30頭の乳牛のうちの24頭に対して帝王切開を行なった。帝王切開により得られた胎仔と流産した胎仔の合計26頭をBVDVの単離に関して評価した(表6)。【0107】T1プラセボ群からの乳牛1317は、238日目に胎仔を流産した(妊娠201日目、攻撃接種後121日目)。胎仔の組織病理学的評価と細菌学的評価によって肺炎と絨毛膜上皮の壊死が明らかになり、胃と胎盤からコリネバクテリウム属が単離された。乳牛からの対となる血清サンプルは、IBR、BVD、レプトスピラ症が病因であることを示していなかった。脳、目、胸腺に関する細胞培養物において、BVDVの単離に関して陽性の結果が得られたが、胎仔の脾臓では陰性であった。BVDVに関して免疫組織化学的に陽性であった。拠から、BVDVに感染した胎仔は、攻撃接種の結果としてウイルス血症になった雌親が流産したことが示唆される。なっていることが明らかになった。胃の内容物と肺に関する培養物が腸内細菌によって厚く覆われた。乳牛からの対となる血清サンプルは、IBR、BVD、レプトスピラ症が病因であることを示していなかった。関する細胞培養物からBVDVを単離する試みは、すべて陰性であった。胎仔組織に関する免疫組織化学の結果は陰性であった。プールした胎仔組織は、細胞培養物でのBVDV単離に関して陽性であった。この矛盾する結果は、胎仔組織が、BVD攻撃接種・ウイルスが播かれている牧場との接触によって汚染されたか、BVDVを以前に単離した検死施設における媒介物によって汚染された可能性があることを示唆している。雌親の体内に攻撃接種後のウイルス血症がなく、陽性へのセロコンバージョン状態がなく、特定の胎仔器官でBVDVの単離が陰性であると、攻撃接種の結果としてこの胎仔がBVDVに感染することはなかったという結論が支持されることになる。帝王切開によって生まれたそれぞれの胎仔から回収した血液サンプルに関し、BVDV1型と2型に対するSM力価を調べた。T1プラセボ群からの帝王切開による7頭の胎仔のどれも、BVDV1型と2型に関して血清反応は陽性でなかった。T2接種群とT3接種群からの帝王切開による17頭の胎仔のうちの5頭は、BVDV1型に対する血清反応が陽性であった。4頭の胎仔は1型に対するSM力価が1:2〜1:4であり、T2群の乳牛1421からの胎仔は、1型に対するSM力価が1:181であり、2型に対するSM力価が1:512であった。攻撃接種後にウイルスを単離した結果を表9に示してある。T1プラセボ群からの10頭の乳牛のうちの9頭は、BVDVウイルス血症になった。これは、生存できる攻撃接種が起こったことを示している。T2接種群とT3接種群の20頭のうちの19頭からの血液サンプルは、攻撃接種後の8つのサンプルそれぞれにおいて、BVDVウイルス血症に関して陰性であった。T2接種群の乳牛1421は、攻撃接種後6日目の123日目にBVDVに関して陽性であり、上記のように血清反応が陽性だがウイルス単離に関しては陰性の胎仔を産んだ。T2接種群とT3接種群における攻撃接種後のBVDVウイルス血症が5%というのは、対照における90%と比べて有意に少なかった(P≦0.0001)。接種群の18頭のうちの2頭(11.1%)、すなわちT2の乳牛1301と1335からの胎仔組織は、BVDVの単離に関して陽性であった。これをT1プラセボ群の乳牛からの胎仔8頭のうちの8頭(100%)でBVDVが単離されたことと比べると、統計的な有意差がある(P≦0.0001)。BVDVの単離結果は、T1群の乳牛1317を除き、評価した他のすべての胎仔組織でBVDV陽性またはBVDV陰性のどちらかであった。乳牛1317に関しては、4つの胎仔組織サンプルのうちの3つで陽性であった。接種群20頭のうちの2頭(10.0%)からの羊水は、BVDVに関して陽性であった。それに対してT1プラセボ群の乳牛では、10頭のうちの10頭で陽性の結果であり、統計的な有意差がある(P≦0.0001)。T2接種群の乳牛1301と1335からの羊水サンプルが陽性であった。免疫組織化学の結果は、接種群の18頭のうちの2頭(11.1%)、すなわちT2の乳牛1301と1335からの胎仔組織に関してBVDV陽性であった。接種したこれら乳牛からの胎仔組織はすべて、陽性であった。これは、細胞培養法を利用して羊水と胎仔組織からウイルスを単離しようと試みたときの同じ2頭のウシに関するBVDV単離結果に対応していた。T1プラセボ群の乳牛8頭のうちの8頭からの胎仔組織はすべて陽性であり、接種群の乳牛での頻度と比べて統計的に有意に多い(P≦0.0001)。【0113】BVDVの単離結果が陽性であった接種した3頭の乳牛に関する攻撃接種前の血清状態を表10に示してある。BVDVが陽性の胎仔を産んだ乳牛1301および1335と、ウイルス血症であった乳牛1421はすべて、ワクチン接種に免疫応答した。接種した乳牛からの胎仔18頭のうちの16頭(88.9%)は、接種していない対照で胎仔を100%感染させた攻撃接種に対して抵抗力があった。鼻腔内攻撃接種により、感染の天然経路を真似ただけでなく、野外で曝露するときに予想されるよりもはるかに多い量で攻撃接種を行なった。攻撃接種の効力は、実験的にBVDV1型ウイルス血症と胎仔の感染を確実に実現できることが以前の研究でわかっているレベルも超えていた。V.S.の「ウシ・ウイルス性下痢症ウイルスと粘膜疾患」。血清学的データにより、IMとSCの両方の投与経路でワクチンの抗原性が確認された。接種したすべての乳牛は、両方のタイプのBVDVに対してセロコンバージョンした。攻撃接種に対する顕著な既往性応答(表7と表8)により、GMT力価の値が6ヶ月後に研究を終えるときまで維持された。ウイルスの単離に関して陽性であることと関係している接種した3頭の乳牛も、接種後にセロコンバージョンした(表10)。血清反応陽性の乳牛1301と1355を帝王切開して生まれた子牛は、BVDVに関して陽性であった。血清反応が陽性の乳牛またはその胎仔からのウイルス単離結果は、体液性抗体が保護と関係しているものの、それが唯一の決定要因ではないことを示唆している。細胞メカニズムまたは粘膜メカニズムも関与している可能性がある。1)クイルAを含む2.5%アンフィジェン/コレステロール(それぞれ250mcg/ml)と、2)アンフィジェン/Alゲルという2つのアジュバント製剤から調製したレプトスピラ・ハージョ/レプトスピラ・ポモナ混合ワクチン2mlを、16頭の家畜からなる2つのグループに3週間の間隔で2回皮下接種した。このワクチンは死んだレプトスピラで構成されており、レプトスピラから培養液を除去することで遊離した内毒素が少なくなっている。体温、注射部位の反応、全体的な健康所見を、2回の注射後に記録した。全身性の悪い効果は見られず、局所反応は最小限であったため、臨床的に許容可能であると判断した。対照として、別の16頭に生理食塩水を注射した。接種してから4週間後、5×106個のレプトスピラを用いて家畜の目と膣に3日連続で攻撃接種を行なった。それぞれの処理群の半分にはハージョを用い、半分にはポモナを用いて攻撃接種を行なった。ポモナを用いた対照のうちの2頭はある理由により研究から除いたため、その群には6頭が残った。(FA)によって評価した。【0122】レプトスピラ・ハージョを用いた攻撃接種の後、生き延びた生物が、接種していない対照のすべて(8/8)で尿培養物および/または腎臓培養物に検出された。それに対して接種したどの動物でも、陽性の培養物は得られなかった(0/16)。レプトスピラ・ポモナを用いた攻撃接種の後、接種していない対照の67%(4/6)が尿/腎臓培養物のレベルで感染していたが、接種したどの動物でも腎臓培養物または尿培養物が陽性になることはなかった(0/16)。【0123】レプトスピラ症は汚染された尿を通じて移るため、放尿を防いだり少なくしたりする能力が、ワクチンの効力に関する有効な指標である。どちらのワクチン組成物も、尿によるレプトスピラの放散を対照と比較して統計的に有意な程度に低下させた。データは、いずれかのアジュバントを用いて調製した二価のレプトスピラ・ハージョ/レプトスピラ・ポモナ・ワクチンを接種することの実質的な利点を示している。これは、ホルマリンで殺した組み合わせバクテリンを接種することにより、家畜がレプトスピラの感染から保護されることを示している。BVDVとレプトスピラに関して血清反応陰性(すなわちBVDV血清中和[SN]力価が<1:2であり、レプトスピラの血清型ハージョとポモナの[MAT]力価が<1:20)である年齢が約7ヶ月の36頭の子牛を複数の供給源から取得し、研究期間中、ネブラスカの研究用隔離施設で保管した。それぞれの子牛は、それぞれの耳に1つずつ付けたタグによって特定した。子牛が耳のタグを紛失した場合には、新しいタグを取り付けた。研究を始める前に、クロストリジウム症とウシ呼吸器疾患に対する薬をテスト用のウシに接種した(BVDウイルスは除く)。テスト用の子牛を担当獣医の監督下に置いた。獣医は、臨床面からウシを毎日観察した。テスト用ワクチンは、ホルマリンで不活化したレプトスピラ・ハージョ-ボビスとレプトスピラ・ポモナの一方または両方と、不活化したBVD1型と2型のウイルスを含む液体ワクチンであった。BVDV成分は、減菌アジュバントと混合した。BVDV免疫化抗原の効力は、ワクチン調製物で使用したバルク流体について8回行なった滴定の幾何平均力価(GMT)を計算することによって明らかにした。レプトスピラ免疫化抗原の効力は、ハムスター致死率モデルの手続きに従って決定した。実験用テスト・ワクチンに含まれるアジュバントは、クイルAを含む2.5%(v/v)アンフィジェン/コレステロール(それぞれ250mcg/ml)だけ、あるいはそれに2%(v/v)水酸化アルミニウムを加えたものと;クイルAを含む2.5%(v/v)アンフィジェン/ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)(それぞれ100mcg/ml)だけ、あるいは2%(v/v)水酸化アルミニウムを加えたもの、のいずれかを含んでいた。実験用テスト・ワクチンは、皮下(SC)注射により5mlを投与した。一価レプトスピラ・ハージョ-ボビス・バクテリンを、製造者の指示に従って陽性の対照として用いた。生理食塩水を含むプラセボ・ワクチンを陰性の対照として用いた。レプトスピラ・ボルグペテルセニイの血清型ハージョ・タイプであるハージョ-ボビス株203(国立動物疾患センター、エイムズ、アイオワ州)を攻撃接種剤として利用した。レプトスピラ・ハージョ-ボビスという攻撃接種材料は、実験的にレプトスピラ・ハージョ-ボビスを感染させた家畜の尿から単離した初代継代培養生物として調製した。この攻撃接種材料を1日に1回、3日連続で投与した。攻撃接種を行なう日ごとに、レプトスピラ・ハージョ-ボビスを1mlに約2.5×106個含む合計2mlの攻撃接種材料を別々の3つの解剖学的部位に投与した。攻撃接種経路は、両方の目の結膜嚢(それぞれ1/2ml)と膣(1ml)への滴注にした。ウシ細胞培養物におけるウイルス一定・血清減少アッセイにより、BVDV1型と2型に関する血清中和力価を測定した。血清の系列希釈物を、50-300TCID50の細胞変性BVDV1型5960株、あるいはほぼ同量の細胞変性BVDV2型125c株と混合した。(MAT)は、設備の整った獣医学診断センター(コーネル大学、獣医学カレッジ、診断研究室)で標準的な方法を利用して測定した。尿サンプルと腎臓組織ホモジェネート(左右の腎臓をプールしたもの)にレプトスピラが存在しているかどうかを調べた。尿と腎臓の培養物にレプトスピラが存在しているかどうかを、標準的な手続きを利用して週に1回、8週間にわたって調べた。標準的なやり方でレプトスピラ蛍光抗体(FA)法を設備の整った獣医学診断センター(コーネル大学、獣医学カレッジ、診断研究室)で実施した。攻撃接種後に保護されたことを証明するため、レプトスピラの感染事象が統計的に有意に減少したことを、接種した群(表11)(T02、T03、T04、T05)とプラセボ対照群(T1)で比較して明らかにする必要があった。腎臓移植と放尿に関するデータを処理法と時期に関してまとめた。それぞれの処理につき、腎臓でレプトスピラが検出された子牛の割合を比較した。それぞれの処理につき、尿でレプトスピラが検出された子牛の割合を比較した。フィッシャーの正確検定を利用してこのような分析を行なった。一般的な線形混合モデルを利用し、レプトスピラが尿に放出される期間も比較した。確率の値としてP≦0.05を利用し、統計的有意さを明らかにした。表11に示したように、テストした36頭の子牛をランダムに6つのテスト群に割り当てた。0日目と21日目に、T01〜T05に割り当てたそれぞれの子牛に、適切な実験用テスト・ワクチンまたはプラセボ・ワクチン5mlを1回皮下投与した。0日目と28日目に、T06に割り当てたそれぞれの子牛に、陽性の対照となるワクチン2mlを1回皮下投与した。57〜59日目に、すべての子牛に対し、すでに概略を説明したレプトスピラ・ハージョ-ボビス203株を用いて攻撃接種を行なった。【0131】0日目、21日目、35日目、56日目、84日目、111日目に血液サンプルをそれぞれの子牛から回収し、BVDV1型と2型の力価を測定した。-1日目、56日目、70日目、77日目、84日目、91日目、98日目、105日目に尿サンプル(約45ml)をそれぞれの子牛から回収し、すでに説明したようにしてレプトスピラを単離した。112日目と113日目に子牛を安楽死させ、腎臓にレプトスピラが存在しているかどうかをすでに説明したようにして調べた。GMT値(表12)から、BVDV-レプトスピラ混合ワクチンを受けたすべての子牛(T02、T03、T04、T05)において、ワクチンを2回投与した後に血清反応が誘導されたことがわかる。T02、T03、T04、T05の群に属するすべての子牛は、2回目のワクチンを投与した後にBVDV1型に対してセロコンバージョンした(SN力価≧1:8)。T02、T04、T05の群に属するすべての子牛は、2回目のワクチンを投与した後に対してBVDV2型にセロコンバージョンした(SN力価≧1:8)。プラセボ群(T01)または一価のレプトスピラ・ハージョ-ボビス・ワクチンを受けた群のすべての子牛は、BVDV1型と2型の両方に対して血清反応が陰性のままであった。これは、この研究が偶発的な曝露によって無効にならなかったことを示している。全体として、BVDVの血清学的データは、不活化したBVDV1型および2型と、不活化したレプトスピラ・ハージョ-ボビスおよびレプトスピラ・ポモナとを4通りの異なるアジュバントの中に含む混合ワクチンが、家畜のBVDV疾患に対する保護応答を誘導できることを初めて示している。SN力価が≧1:8であるというのは、BVDV疾患から保護されていることを示す、ということが従来から知られているからである。尿と腎臓におけるレプトスピラの結果(表13)から、BVDV-レプトスピラ混合ワクチンを受けたすべての子牛(T02、T03、T04、T05)が、テストした8つの時期のすべての尿培養物(CX)について陰性であり、剖検時(112日目または113日目)に採取した腎臓の培養物について陰性であったことがわかる(表13、8列)。一価レプトスピラ・ワクチンを受けた子牛(T06、陽性の対照)は、レプトスピラの感染から同様に保護された。逆に、プラセボ・ワクチンを受けた子牛(T01、陰性の対照)は、尿培養物(表13、2列)と腎臓培養物(表13、8列)での結果に基づくと感染していた。これは、攻撃接種に対するワクチンの研究が有効であったことを示している。全体として、レプトスピラ・ハージョ-ボビス単離のデータは、不活化したBVDV1型および2型と、不活化したレプトスピラ・ハージョ-ボビスおよびレプトスピラ・ポモナとを4通りの異なるアジュバントの中に含む混合ワクチンが、家畜のBVDV疾患に対する保護応答を誘導できることを初めて示している。獣医学的に許容される基剤、を含むワクチン組成物。した雄牛、去勢していない雄牛のいずれかである、請求項8に記載の方法。ekouhou.net。