それぞれ、mtおよびcpゲノムへのリードの〜20%および〜80%がマッピングされる)。;この分析に含まれる6個のライブラリーは別個の分析のために6個のライブラリーとともにプールされ、合計12個のライブラリー単一のシークエンシングレーンにプールされている)。)を調べることによって達成された。MF法では、ベースあたりの平均カバレッジは、mtゲノムで約300〜450X、cpゲノムでは4,000〜5,000Xでした。DC法では、mtおよびcpゲノムの平均塩基対当たりの被覆率は、それぞれ約900-1,300および約500-700Xであった。オルガネラゲノム間の相同性領域に相当する可能性があり、低いカバレッジ領域は、配列決定された品種と公開された参考文献との間のSNPまたは他の小さな変異体を示し得る。)由来のmtDNAについて最も顕著であった。DNAに沿ったMBD2-Fcプルダウンのわずかな偏りに起因する可能性がある。これが当てはまるのかを判断するには、さらなる実験が必要になります。それにもかかわらず、mtおよびcpゲノムはどちらの方法でも比較的均一なカバレッジを有し、カバレッジの欠如はほとんどなかった。両方のゲノムのカバレッジのレベルは、変異分析のような下流分析に十分であると考えられる。まれな変種の分析に必要と思われる場合は、r個のプールされたサンプルは、より大きなカバレッジを達成するだろう。MiSeqライブラリーとは対照的にPE150の長さに制限されているため、より多くのサンプルをHiSeqレーンにプールすることができますが、シーケンシングの長さを犠牲にしています。マッピングアプローチを用いて核ゲノム汚染のレベルを調べるために、PE読み取りマッピングカテゴリーを調べた。PE読み取りは、様々な構成で参照ゲノムにマッピングすることができる。"予想される"距離がある場合(ライブラリの平均挿入サイズに基づいており、通常はマッピングソフトウェアの入力パラメータとして指定されます)、これらのPE読み取りは「一致して」マッピングされていると言われています。対照的に、「不一致」のマッピングは、仲間が予想よりも小さいかより大きなものをマップする状況です参照ゲノムまたはマップに交互配置(頭から尾まで、または尾から尾まで)で交配することができます。1つのメイトだけが参照ゲノムに整列するならば、そのPE読取りは、参照ゲノムに一致しても不一致でもないと言われる。3つのすべての読み取りマッピングカテゴリにおいて、PE読み取りは、参照ゲノムに1回または複数回整列させることができる。)、葉緑体ゲノムに存在する大きな逆方向反復および非常に高いカバレッジレベルに起因する可能性がある。1人の仲間だけがマップすることができる)。これらは、オルガネラゲノムまたはミスアセンブルされた領域に相同である、核ゲノム中の配列に「オフターゲット」をマッピングする可能性が最も高い。Spring非致死組織由来のMBD2-Fcプルダウン後の核画分もまた配列決定され、プルダウンが非メチル化DNAの除去においていかに効率的であるかを決定した。ほとんどの読み込みは不一致な方法でマップされます。w小麦核参照ゲノムにおける高レベルの誤組合および断片化を反映している可能性が高い。それにもかかわらず、結果は、MBD2-Fcプルダウンが、メチル化核DNAからの非メチル化細胞小器官DNAの除去において非常に効率的であることを示唆している。これらの方法から得られた細胞小器官に富むDNAはミトコンドリアと葉緑体配列の混合物を含んでおり、これらのオルガネラ間の古代の遺伝子伝達に起因する配列類似性がそのゲノムに残っているため、ゲノムは生物情報学的に解決されなければならない。葉組織の切除は、オルガネラの豊富さを見事に変えない:伝統的に、エトホルテーションされた組織は、フェノール性物質およびデンプンのレベルを低下させるために植物ミトコンドリアDNA単離に好ましいが、これは抽出物を妨害し得るnまたは下流のアプリケーション13。オルガネラゲノムの濃縮レベルが成長条件によって変化し得るか、または改善され得るかどうかを決定するために、腐敗組織および非腐敗組織の両方をMFプロトコルおよび配列決定に供した。)にマッピングされた読み取りの割合を感知可能に変化させなかった。我々はまた、疎外された組織および非腸化された組織の両方を用いて、分画遠心分離を用いてオルガネラDNAを単離し、qPCRを用いて異なる組織間での濃縮の差はほとんど見られなかった(データ示さず)。これは、オルガネラの配列決定研究に生理的に関連性の高い非致死的な組織を用いることができることを示唆している。DNAは長時間読み取り配列に最適です:長いリードシークエンシングが研究者にとってよりアクセスしやすくなるにつれて、高分子量DNAの単離がますます重要になってきています。いずれかの方法で単離された細胞小器官DNAをインタクト性および品質について評価するために、PFGEを用いた。総ゲノムDNAは、典型的にはPFGEのびまん性塗抹標本として移動し、分子量はプロトコルおよびDNAがどのように保存後保存後に処理されたかによって決定される。Kitへの入力として使用されます。これはsuではありませんMBD2-Fc結合ビーズからの溶出としての核画分の比較的粗い取り扱いが、熱およびプロテイナーゼK消化を必要とすることを考えると、驚くべきことである。50kbを示した(データは示していない)。分画遠心分離で得られたオルガネラDNAは、平均オルガネラ単離プロトコールおよびその後のカラムに基づくDNAの抽出および濃縮に起因すると考えられる〜20kbの平均質量を有する。グラジエントベースの細胞小器官単離および代替のDNA抽出法は、より大きなDNA断片サイズを維持し得る。いずれにしても、このプロトコールで得られたサイズのDNAを用いて、ライブラリー調製中に注意を払うと10または15kbのシークエンシングリードを生成することができる。DNAのために濃縮する。)と対比されています。サンプルの凍結および融解を避けることを推奨します。