)この表は、組織入力、必要な植物の数、DNA出力、および結果として生じるDNAサイズの点で方法を比較する。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。図2:2つの方法を用いて分離したオルガネラDNAにおける核DNA汚染の評価。(Y軸)は、標的増幅からの蛍光がバックグラウンド蛍光レベルを上回って増加するPCRサイクルである。NAD3およびPSBBはそれぞれミトコンドリア特異的および葉緑体特異的である。エラーバーは、各サンプルの3つの技術的複製の間の標準偏差を示す。MBD2-Fcによって結合されないDNAの非メチル化画分、MBD2-Fcで処理されていない全gDNA-ゲノムDNA、MBD2-Fcによって結合されたDNAのメチル化画分。q値、およびACTINに対するオルガネラアンプリコンの倍濃縮を示す。この式は、各プライマーセットについて2の完全効率を仮定している。1.989)にほとんど影響しない。プライマー効率は、全ゲノムDNAの一連の5つの1:10希釈液で標準曲線を作成することによって評価した。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。図3:葉緑体およびミトコンドリアゲノムの読み取りマッピングおよび理論的範囲。)中国春の参照ゲノムにマップされた読み込みの割合。)参照遺伝子の対応する理論上の適用範囲mes、ゲノムサイズがそれぞれ450kbおよび135kbであると仮定して、総リード数および異なるゲノムにマッピングされたリードのパーセンテージを用いて計算した。)からのオルガネラDNAのためのカバレッジのゲノムワイド分布。Hは、中国スプリング黄化試料からのものであるが、他のすべての試料は同様の傾向を示しました。「E」を含む試料ラベルは漂白試料を示し、「NE」は非漂白試料を示す。DCは分画遠心分離法で単離したDNAを示し、非メチル化はMBD2-Fc(MFプロトコル)でプルダウンした後の非メチル化画分に存在するDNAを示す。Springのサンプルを指定します。注:オルガネラゲノムとオルガネラゲノムとの間、およびオルガネラゲノムと核ゲノムとの間の古代の遺伝子移入に起因する葉緑体、ミトコンドリアおよび核ゲノム間の配列相同性のために、未処理の読み込みのわずかな割合が複数のゲノムにマッピングされ得る。どちらの細胞小器官参照ゲノムにもマップされていない読み取りは、この図には示されていません。)は合計100%ではありません。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。図4:小麦核ゲノムへのPE読み取りマッピング。核(C)中国春の参照ゲノムにマッピングタイプを読み込みます。NEは非漂白サンプルを示す。DCは、分画遠心分離法で単離されたDNAを示し、非メチル化は、MFプロトコルでMBD2-Fcでプルダウン後の非メチル化画分にあるDNAを示し、Methylatedは、MBD2-Fcプルダウン後の核画分を示す。'Chris'を示しています。Spring'のサンプルを指定します。マッピングされていない読み取りは表示されません。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。"/>図5:PFGEを用いたDNA品質の検討分画遠心分離(レーン3)から得られたコムギ総ゲノムDNA(レーン2)、小麦細胞小器官DNA(レーン3)、およびMBD2-Fcプルダウンアプローチを用いたMF後の核画分(レーン4)を、1%アガロースゲルでPFGEマーカーとして使用される1kbの拡大ラダー(レーン1およびレーン5)。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。スクロース、トリス、EDTAのみを含むバッファーミックスは1ヶ月前に調製し、4°Cで保存することができます。PVP、BSA、およびBMEは、使用直前に必要な量の緩衝液のアリコートに新たに添加する必要があります。スクロースとトリスのみを含むバッファーミックスは、1ヶ月前までに調製し、4°Cで保存することができます。STバッファーはEDTAまたはBMEを含まず、BSAの濃度がより低いことに注意してください。-20°Cで200μlのアリコートを保存する。DNaseワーキング溶液(1サンプルあたり200μlのDNase溶液)を調製するには、以下の表1。DNase消化の詳細については、以下の全プロトコールを参照してください。DNase作業溶液は新鮮な状態で調製する必要があります。EDTAです、詳細はフルプロトコールを参照)。サンプルあたり200μlを新鮮に調製する。(200μlDNase溶液量に基づく)、および133.5μlのSTバッファー200μlの最終容量。溶解酵素を除くすべての成分を混合し、室温で保存する。溶解酵素は、直ちに使用するために少量ずつ新しいものに添加する必要があります。方法2表1:自家製のバッファーと作業用ストックのレシピ。2回目のスピンの後の体積(ul、空白から空の重量を差し引いたもの)実際の回復されたボリュームは、計算されたボリュームよりも数ul少ないことに注意してください。表2:濃度ワークシート。GCTGCCTGTTTCCTTGTAGTT表3:qPCRプライマーのリスト。librarian.Discussion今日まで、ほとんどのオルガネラ配列研究は、特定のDNAを豊富にする伝統的なDC法を中心に研究しています。モス40を含む多様な植物からオルガネラを単離する方法が記載されている。ナタネ14などの双子葉植物が挙げられる。ほとんどのプロトコルは、いくつかの種子11を含む組織型の種々のために適合されたもので、葉組織13、14、15、16、17に焦点を当てます。プロトプラストからのオルガネラの単離もまた実証されている41。これはすべてのシステムに受け入れられず、関心組織が限られている場合には実現可能でもない。これらのオルガの多く生理学的研究のような特定の実験のために無傷の細胞小器官を回収するためのネラール単離法を設計した。5g以上のキログラムを必要とする、スクロースまたはパーコール勾配のような密度勾配の使用を必要とする。DC法は、スピン速度および密度勾配を変化させることによって、ミトコンドリアまたは葉緑体などの特定の細胞分画を富化するように最適化することができる。対照的に、MFアプローチは出発材料(20mg)をはるかに必要とするが、ミトコンドリアおよびプラスチドのDNAは、DNA抽出に使用される組織中のそれらの相対存在量につき存在するであろう。それにもかかわらず、MFプロトコルは、混合オルガネラDNAを単離するための代替的なアプローチを提供し、少量の組織で開始する場合に特に有益である。Oオルガネラ単離後のサンプルの純度を評価するため、これまでのほとんどの研究は、エンドポイントPCRおよびゲル電気泳動11,12を使用します。これは、サンプルの純度の公正な定性的尺度を与える。低レベルの増幅は、アガロースゲル上で視覚化されないことがある。14などの品質管理のより定量的な尺度が含まれています。両方の方法から単離されたDNAサンプル純度の定量的評価のために、qPCRおよびシークエンシングを利用して、サンプル中の核DNAの量ならびにミトコンドリアDNAと葉緑体DNAの相対的比率を決定した。ここで評価した両方の方法は、核DNAを除去するのに有効です。暗闇の中で成長する植物(テルモレーション)は、フェノール系物質の減少によるオルガネラの単離を促進すると報告されているしかし、この比較では、光を発したサンプルよりも腐敗した組織での作業には大きな利点は見いだせなかったが、特殊な葉緑体の割合は、光が生育すると高くなると思われるが、葉緑体ゲノムにマッピングされている読みの割合に反映されているが、異なる光条件では変化しないため、異なる組織または異なるストレッサー下でのヘテロプラスミーの評価や発現解析などの下流機能解析では、生理学的に関連する条件下で成長した植物。短リードシーケンシング技術を用いたアプリケーションでは、ここで比較した両方の技術が十分なDNA量と品質をもたらします。1分子シークエンシングアプリケーションで20kbを超える長い読み取りを達成するためには、より高品質のDNAがより多く必要です。kb挿入ライブラリー調製物のための社内の低入力プロトコールに必要です42。ngのにまたは20でもそれ以下)を減らすことができるが、課題は、高品質、ライブラリの準備に入る高分子量のDNAを持っていません。20kbであることが不可欠である。小さい断片が優先的にSMRTbellに挿入され、ライブラリー43のサイズ分布を捨てるからである。私たちは、自家製のDNA抽出プロトコールと、DNA抽出のためのいくつかの商業プロトコール(図示せず)を試みた。小麦葉組織について、DNAの量と質との間の最適なバランス、特に長さは、市販のキット27、29を用いて得ました。関心のある植物種および組織に応じて、オルタナティve抽出プロトコルは、同様に適しているか、またはより有益であり得る。50kbの高分子量ゲノムDNAの全抽出が、限定された出発物質からの長時間の配列決定に適していると結論する。今後の研究では、ロングインサートライブラリーの調製とそれに続くロングリードシーケンシングの分画に必要な出発物質の限界を試験する必要があります。重要なことに、このアプローチは、全ゲノム増幅を伴わずに、長い読み取り配列に適した単一葉のサブサンプルからDNAを単離する堅牢な方法を提供することができる。我々は、このアプローチが追加の組織タイプに容易に適応可能であり、他の植物種に広く適用可能であると予想している。それは、交差スキームまたはより希少な組織タイプにおける個々の世代での配列決定のような、組織量が制限されている状況において特に有用である。librarian.Disclosures著者らは、競合する利益がないと宣言している。この刊行物に記載されている商号または商品の説明は、特定の情報を提供する目的のみであり、米国農務省の推奨または保証を意味するものではありません。USDAは平等な機会提供者と雇用者です。1361554)からの資金提供を認めたいと思います。Caspersに温室保全とプラントケアに感謝します。イルミナライブラリーの調製と配列決定が行われたミネソタ大学ゲノミクスセンターにも感謝します。私たちはまた、ジャーナル編集者と4人の匿名の査読者からのコメントに感謝して、私たちの原稿をさらに強化しました。我々はまた、OECDに、これらのプロトコルを日本の同僚との共同プロジェクトに統合するためのSKへのフェローシップに感謝する。gdpr@jove.com.。