FavoritesSummary2つの植物細胞小器官DNA濃縮方法の比較および最適化が提示される:従来の分画遠心分離およびメチル化状態に基づく全gDNAの分画。得られたDNAの量と品質を評価し、短期間の次世代シーケンシングでの性能を実証し、長時間読み取り単一分子シークエンシングで使用する可能性について検討します。here.Abstract植物オルガネラゲノムは、複雑な構造および/またはサブゲノム断片を形成するために対合または組換えを受ける可能性がある、大きな反復要素を含む。オルガネラゲノムはまた、所与の細胞または組織型(ヘテロプラスミー)内での混合物として存在し、多量のサブタイプは、発達中またはストレス下で変化し得る(化学量論的部分シフト)。オルガネラゲノムの構造と機能をより深く理解するためには、次世代シーケンシング(NGS)技術が必要です。伝統的な配列決定研究は、細胞小器官DNAを得るためにいくつかの方法を使用する:(1)大量の出発組織を使用する場合、それをホモジナイズし、分画遠心分離および/または勾配精製に供する。(種子、材料、又は空間が限られている場合、すなわち、)(2)組織の少量が使用される場合、同じプロセスが(1)十分なDNAを得るために、全ゲノム増幅に続いてのように行われます。(3)バイオインフォマティクス分析は、seq総ゲノムDNAを調べ、オルガネラの読みを解析する。これらの方法にはすべて固有の課題とトレードオフがあります。(1)では、そのような多量の出発組織を得ることは困難であり得る。(3)において、核ゲノムとオルガネラゲノムとの間の相同性が、アセンブリおよび分析を妨害する可能性がある。大きな核ゲノムを有する植物では、オルガネラDNAを濃縮して、バイオインフォマティクス分析の配列決定コストおよび配列複雑性を低減することが有利である。ここでは、伝統的な微分遠心分離法を第4の方法、適合したCpG-メチルプルダウン法と比較して、全ゲノムDNAを核および細胞小器官画分に分離する。いずれの方法も、ミトコンドリアおよび葉緑体において異なる比率であるにもかかわらず、細胞小器官配列に対して高度に濃縮されたNGS、すなわちDNAに対して十分なDNAを生じる。我々は、小麦の葉組織のためのこれらの方法の最適化を提示し、主要な利点およびdサンプル入力、プロトコルの容易性、および下流のアプリケーションの文脈における各アプローチの長所である。Introductionゲノム配列決定は、重要な植物形質の根底にある遺伝的根拠を解明するための強力なツールです。ほとんどのゲノムシーケンシング研究は、遺伝子の大部分が核内に位置するため、核ゲノムの内容に焦点を当てています。動作)を含む細胞小器官のゲノムは、生物の開発、ストレス応答、および全体的なフィットネス1に不可欠な重要な遺伝情報を貢献します。オルガネラゲノムは、通常、核ゲノム配列決定を目的とした全DNA抽出に含まれますが、DNA抽出に先立つオルガネラ数を減らす方法も使用されています2。多くの人がしている読み取るための研究の目標は、合計のgDNAは、シーケンシングコストを増大させ使用して、細胞小器官のゲノムに焦点を当てているとき、『特に大きな核ゲノムを有する植物で、核DNA配列に』失われましたまた、による核ゲノム中へのオルガネラ配列の複製、転写および細胞小器官の間に、配列決定の正しいマッピング位置を解決することは、適切なゲノムに読み出しバイオインフォマティクス2,8に挑戦されている。核ゲノムからオルガネラゲノムの精製が1でありますミトコンドリアと葉緑体との間の相同性領域にマッピングされる読み取りを分離するために、さらなるバイオインフォマティクス戦略を使用することができる。多くの植物種からのオルガネラゲノムが配列決定されているが、オルガネラゲノム多様性の幅についてはほとんど知られていない野生の集団または栽培された繁殖プールで利用可能である。オルガネラゲノムはまた、反復配列間の組換えのために重要な構造的再編成を受ける動的分子であることが知られている9。オルガネラゲノムの複数のコピーが各オルガネラ内に含まれ、複数のオルガネラが各細胞内に含まれる。これらのゲノムの全てのコピーが同一であるとは限らず、ヘテロプラスミーとして知られている。コンカテマー、分枝構造など、細胞小器官ゲノム構造のより複雑な画像の証拠が増えています10。植物オルガネラゲノムの集合は、それらの比較的大きなサイズおよび実質的な逆方向反復および直接反復によってさらに複雑になる。E配列は、多くの場合、煩雑であり、いくつかのグラム、組織入力の大容量を必要とするように上方に始点11、12、13、14、15、16、17、必要に応じて、若い葉の組織のグラム数百。これは、組織が限られている場合、細胞小器官のゲノム配列決定が不可能になります。いくつかの状況では、交配によって維持されなければならない雄性不稔性系統または世代別に配列決定する必要がある場合など、種子の量は限られる。このような状況では、細胞小器官のDNAを精製してから全ゲノム増幅を行うことができます。短リードシーケンシング技術のライブラリ作成における最近の進歩は、全ゲノム増幅を回避するために低入力障壁を克服してきた。ngのDNAを入力19として使用できます。Nanopore配列決定技術のような長時間配列決定アプリケーションのための標準ライブラリー調製は、オルガネラゲノム配列決定のための課題を提起することができる比較的多量の入力DNAを依然として必要とする。最近、新しいユーザー作られた、長読みシーケンシングプロトコルは、入力量を低減し、DNAのマイクログラム-量を得ることが21、20困難なサンプルではゲノム配列決定を促進するために開発されてきました。これらのライブラリー調製物に供給するための高分子量の純粋なオルガネラ画分を得ることは、依然として課題である。私たちは全ゲノム増幅を必要とせずに、NGSに適したオルガネラDNA濃縮および単離法を比較し最適化する。DNAを濃縮するためのベストプラクティスを決定することでした。CpG-メチル結合ドメインタンパク質プルダウンアプローチの使用に基づく(2)DNA分画プロトコルに対する、改変された伝統的な微分遠心分離プロトコルである細胞小器官DNAを濃縮する方法の比較分析を提示する22は、組織23を植える適用しました。我々は、小麦葉組織からのオルガネラDNAの単離のためのベストプラクティスを推奨しており、これは他の植物および組織タイプに容易に拡張することができる。小麦の苗の標準的な成長バーミキュライトの植物の種子を角のついた4〜6個の種子を持つ小さな四角い鉢に入れる。18°Cの夜間温室または成長チャンバーに移す。毎日植物に水を注ぎます。NPK肥料の1⁄4ティースプーンで植物を肥料化する。18°Cで8時間置きます。貯蔵容器を用いるが、適切な換気が維持されなければならない)。成長および組織収集12〜14日間植物を栽培してください。ほとんどの小麦遺伝子型苗の75〜100苗は約10〜12gの組織を産生し、これは分画遠心分離法(セクション2)を用いた2回の細胞小器官の抽出に十分である。CpG-メチル化に基づくプルダウン法を利用する場合には、1つの植物のみが必要である(第3節)。ディファレンシャル遠心法を利用する場合は、組織を新鮮なものにして、セクション2で説明したように、サンプルの処理に直ちに進んでください。代表的な結果を参照して、いずれかの標準の成長または黄化組織を使用)。液体窒素でスナップフリーズし、使用するまで-80°Cで凍らせます。セクション3で説明したように、DNAのプルダウン分画に進みます。注:differential遠心分離プロトコルは、両方の細胞小器官を単離が、ミトコンドリア17、24を濃縮するために条件を最適化された2巻の刊行物から改変しました。得られたプロトコールは、従来の方法よりも時間がかかりにくく、毒性の少ない化学物質を使用する。具体的には、STE抽出緩衝液へのポリビニルピロリドン(PVP)の添加およびフッ化ナトリウム(NaF)を含有するNETF緩衝液中の最終洗浄工程の除去を含む、緩衝液および洗浄工程を改変した。注意:STE緩衝液の調製および使用は、このバッファーに2-メルカプトエタノール(BME)が含まれているため、適切な個人用保護具を備えた化学薬品フードの下で行う必要があります。注:クロスコンタミネーションを避けるために、ピペッティングが必要なすべての手順に、フィルターチップを使用することをお勧めします。)のために必要な緩衝液と作業ストックを準備する。極低温粉砕ブロックを-20°Cに冷却し、ローターとバッファーを4°Cに冷却し、微量遠心分離機を4°Cに設定し、37°Cの水槽に入れます。新鮮な組織を5g採取し、冷たいビーカーの氷冷した滅菌水ですすいでください。注記:遠心分離機、ヒュームフードなどのすべての操作および輸送中は、サンプルを氷上に置いておきます。プロトコールを実行するのに十分なスペースと設備があれば、冷蔵室で作業してください。はさみを使用して、葉の組織を2cmのセラミック研削を含む50mLのチューブに直接〜1cm片に切断するシリンダー。注:クロスコンタミネーションを避けるために、サンプル間のハサミを清掃または交換してください。組織ホモジナイザーがない場合は、乳鉢と乳棒を使用して、ステップ2.2.4-22.9を置き換える。氷上のあらかじめ冷却した乳鉢に葉組織を切断する。15mLのSTE(ヒュームフード内)で2〜3分間サンプルを粉砕する。バッファーをあらかじめ濡らした滅菌濾過クロス(〜22μm〜25μmの孔径;詳細は主なプロトコールを参照)の1層を含む漏斗を通して緩衝液(モルタル中に組織を残す)から別の50mLチューブ。mLのSTEを乳鉢に加え、乳棒で掻き混ぜ、再度ホモジナイズする。ホモジナイズした組織とバッファーを同じ漏斗に注ぎます。乳鉢をすすぎ、10mLのSTEで乳化し、漏斗に注ぐ。できるだけ多くの液体を回収するために、濾布を絞って漏斗に絞ってください。注:クロスコンタミネーションを避けるために、サンプル間の手袋を交換してください。プロと続けるステップ2.2.10でトコール。mLのSTE(ヒュームフード内)を添加する。試料を、組織粉砕装置中の予め冷却した極低温粉砕ブロックに入れ、1,750rpmで2×30秒間試料を粉砕する。サンプルの位置を回転させ、粉砕の間に約1分間氷上にサンプルを置く。注:乳鉢と乳棒、ブレンダー、または他の組織粉砕/均質化装置をこの工程で使用することができる。各方法は結果として得られるDNA品質に異なる程度で影響を与えるため、DNAの長さおよび品質を評価してから、下流のアプリケーションを続行する必要があります。氷中に置かれた清潔な50mLチューブに漏斗を入れる。ろ液の一層を漏斗に入れ、5mLのSTEであらかじめぬらします。フロースルーを廃棄しないでください。ホモジナイズした組織を漏斗に注ぎます。mLのSTEで粉砕チューブをすすいだ後、チューブを逆さにして反転させて壁と蓋をすすぎ、ファーンに注ぎますエル。慎重に陶器の石を取り除き、濾過布を絞って漏斗に絞ってください。注:クロスコンタミネーションを避けるために、サンプル間の手袋を交換してください。こぼれないようにパラフィルムでチューブキャップを包みます。mLの高速遠心分離チューブに入れます(密封ガスケットがない場合はパラフィンでチューブキャップを包んでください)。xgおよび4°Cで20分間遠心します。チューブのバランスを取るために、氷の小さなビーカーを天びんに置き、風袋を秤量し、サンプルを氷上で秤量して冷たく保ちます。冷たい部屋で天びんとヒュームフードを使用してください。mLのSTを加え、穏やかに再懸濁するやわらかな絵筆を描く。チューブの側面のペイントブラシを押してすべての液体を除去する)。STを使用してチューブを0.1g以内に収めます。xgおよび4°Cで20分間遠心分離する。DNaseI溶液を調製してください(ストック溶液および作業溶液レシピについては表1を参照)。各サンプルについて、1.5mLチューブで200μLのアリコートを1つ作成します。上清を捨て、チューブをブロットし、軟ペイントブラシを使用して300μLのST中でペレット(高速遠心チューブに依然として)を再懸濁する。200μLのDNaseI溶液を含む先に調製した1.5mLチューブにペイントブラシを置き、ペイントブラシを渦巻かせてブラシに付着した残留ペレットを除去する。DNaseI溶液をピペットで高速遠心チューブに戻し、穏やかに混合して混和させます。37°Cで30分間、水浴中でインキュベートする(チューブ上部のパラフィルムを包んで、凝縮漏出を防ぐgをキャップに入れる)。インキュベーションの間に2回旋回させることにより静かに混合する。ピペットチップを用いてペレット混合物をチューブからゆっくりとピペットで広げ、1.5mLの低結合チューブに入れる。8.0を高速遠心管に加え、ゆっくりとピペットで残ったペレットをすべてチューブから取り出します。ペレット混合物と同じ1.5mLの低結合チューブにEDTAを移し、穏やかに転倒混和する。xgで20分間遠心する。上清を捨て、チューブをブロットし、DNA単離のためにすぐに使用する。必要に応じて、-20°Cでペレットを凍結しますが、残存するDNaseIがすぐに処理されないとサンプルDNAを分解させる可能性があるため、収率が低下する可能性があります。Prオルガネラ単離からDNA抽出へ直接移行することが好ましい。反復凍結および融解は、DNA断片サイズを減少させ、残留DNaseIによるDNA分解をもたらす。ボルテックスや激しいピペッティングはDNAを剪断することができますので、制限してください。DNA回収を最大にするために、低結合マイクロ遠心チューブの使用を推奨します。注:バッファが適切に作成/保存され、スピンカラム手順が理解されていることを確認する前に、詳細な商用プロトコール25をお読みください。ATLをチューブに直接添加する(予め凍結してベンチトップ上で室温に平衡化していれば解凍する)。Tissues」の手順3に進み、3×200μLのAEに溶出する。それぞれのパラメートチューブを開き、溶出液を合わせる)。qPCRのためにアリコート(少なくとも20μL)を保存する(ステップ4.1参照)。濃縮前に定量するために、高感度定量のために1μLをさらに保存します。必要に応じて、サンプルの濃縮を進めてください。注:詳細については、商用プロトコル26を参照してください。エンドポイントPCRおよびqPCRアプリケーションのための)サンプル濃縮を行う必要はないかもしれない。NGSライブラリー構築のためには、DNA抽出後に得られる希薄オルガネラDNAを濃縮する必要があると思われる。