Pi合わせた溶出液をフィルターユニットに注入し、再び注意深く秤量する。注:商用マニュアル26によると、フィルタユニットの最大容量は500μLですが、オーバーフローなしで最大575μLをユニットに一度に追加できます。充填されたフィルターユニットをチューブ(カラムに付属)に慎重に置きます。500xgで所望の時間遠心分離して、必要な濃縮物の容量を達成する。〜575μLのサンプル量では、20分のスピンは通常15〜30μLの濃縮液量になります。フィルターユニットをチューブから取り外し、再度秤量します。この表を使用して、所望の濃縮物量が達成されたかどうかを決定する。xgでもう一度短時間遠心し、再び体重を測定します。所望の濃縮物の容量に達するまで繰り返す。新しいチューブ(カラムに付属)をフィルターユニットの上に置き、反転させます。xgで3分間遠心分離して、チューブに移す。回復されたボリュームを決定します。これは通常、フィルターの保持のために、計算された容量より3〜5μL少なくなります。過剰に濃縮された場合は、滅菌水またはTEで希釈して所望の容量を達成する。高感度定量を使用してDNAを定量する(製造業者の指示に従って)。Kitプロトコール28について、ユーザーが開発したゲノムチップキットDNA抽出プロトコルから変更されました。理論的には、高分子量のDNAを生じる任意のDNA単離プロトコールをプルダウンに使用することができる。kb以上の断片を生じる抽出が適切です。lo読取りシーケンシングでは、より大きなフラグメントが望ましい場合があります。したがって、我々は高分子量のDNAを得るためにこのプロトコルを最適化した。)のために必要なバッファーと作業ストックを準備します。溶解緩衝液ストックに溶解酵素を加えて、溶解緩衝液を作用溶液にする。サーモミキサーの電源を入れ、37°Cに設定します。水浴を50°Cにし、QF緩衝液を浴に入れる。冷凍庫に70%EtOHを置き、微量遠心分離機を4°Cに設定する。注:開始する前に、重力流動陰イオン交換カラムの使用に関する詳細については、コマーシャルハンドブック29を参照してください。特別なラックを使用してカラムを設置するか、付属のプラスチックリングを使用してチューブの上に置くことができます。gを含むすべてのステップエノミックチップは、重力流によって進行させるべきであり、残留液体は強制的に通過させてはならない。2mLチューブ用に設計された手持ち式粉砕乳棒を使用して、2mLの低結合チューブ中の液体窒素中の凍結組織20mgを粉砕する。2mLの溶解緩衝液を加える(チューブは非常にいっぱいになる)。rpmで穏やかに攪拌しながら、37°Cのサーモミキサーで1時間インキュベートする。サーモミキサーが利用できない場合は、ヒートブロック上でインキュベートし、15分ごとに穏やかなフリックで混合することが適しています。mL)4μLを添加する。37°Cで30分間、サーモミキサー中で混合し、インキュベートし、300rpmで穏やかに攪拌する。mL)を添加し、混合物に転化させ、300rpmで穏やかに攪拌しながら、50°Cで2時間サーモミキサー中でインキュベートする。4°C、1分間で20分間遠心分離する。不溶性破片をペレット化するために5,000×g。QBTで平衡化し、カラムを重力流によって空にします。ワイドボアピペットチップを使用して、平衡したカラムにサンプルをすばやく塗布し(ペレットを避ける)、完全にカラムに流してください。サンプルは、カラムに適用する前に、再び曇り、フィルターや遠心分離機になった場合(詳細は29商業用ハンドブックを参照してください)。QCでカラムを洗浄する。mLの低結合マイクロ遠心チューブにカラムを懸濁する。QFでゲノムDNAを溶出する。溶出したDNAに0.56mL(0.7容量の溶出バッファー)の室温イソプロパノールを加えてDNAを沈殿させます。逆転(10X)して混合し、すぐに15,000×gおよび4°Cで20分間遠心分離する。お手入れゆるく付着したペレットを妨害することなく上清を完全に除去する。冷たい70%エタノール1mLで遠心分離したDNAペレットを洗浄する。xgおよび4°Cで10分間遠心分離する。ペレットを乱すことなく上清を注意深く除去する(このステップでも注意する)。5〜10分間空気乾燥させ、0.1mLの溶出緩衝液(EB)にDNAを再懸濁する。DNAを室温で一晩溶解させる。DNAを剪断するピペッティングは避けてください。高感度のDNA定量アッセイを使用してサンプルを定量する(製造者の指示に従う)。Fc断片(MBD2-Fcタンパク質)に融合されたCpG特異的メチル結合ドメインタンパク質を利用して、分画するプルダウンアプローチを利用する市販のキット28の使用を示した核ゲノム(高度にメチル化された)含量から植物オルガネラゲノム(非メチル化)を食べた23。コムギ試料中の分画効率は、この市販のMFキット28を用いて以前に試験されなかった。開始前のこと80%エタノール(反応あたり少なくとも800μL)を新鮮に調製する。氷上で解凍するために5x結合/洗浄緩衝液をセットし、サンプルあたり1x緩衝液5mLを調製する(無菌のヌクレアーゼフリー水で5倍に希釈し、プロトコール中に氷上に保つ)。MBD2-Fcタンパク質結合磁気ビーズを調製する必要数のビーズセットを準備します。1〜2μgの全入力DNAを使用するように反応をスケールすると、160〜320μLのビーズが必要です。下に列挙した反応は1μgの全入力DNAに対応するため、160μLのビーズが必要であることに注意してください。必要に応じて反応を拡大します。B均一な懸濁液を作るためにスラリーを上下させる。代わりに、4°Cで15分間ビーズのチューブを静かに回転させます。注:ビーズをボルテックスしないでください。メーカーの説明書28あたりの方向に進みます。メチル化された核DNAを捕獲する個々のサンプルについて、1μgの入力DNAを160μLのMBD2-Fc結合磁気ビーズを含むチューブに加える。4)になるようにDNA入力試料の容量を考慮して、必要に応じて5x結合/洗浄緩衝液を加える。サンプルを数回上下にピペットし、ワイドボアピペットチップを使用して混合します。チューブを室温で15分間回転させる。サンプルをゆっくりとワイドボアピペットチップでピペットにかけ、ビーズ凝集を防ぐためにインキュベーション中2〜3回サンプルをフリックします。注:ピペッティングとフリッキーメチル化DNAの効率的なプルダウンを確実にするために重要である。豊富な非メチル化オルガネラDNAを集めるDNAおよびMBD2-Fc結合磁気ビーズ混合物を含むチューブを短時間スピンさせる。チューブを磁気ラックに少なくとも5分間置いてビーズをチューブの側面に集める。その解決策は明確に見えるはずです。ワイドボアのチップを使用して、ビーズを乱すことなく清澄な上清を注意深く取り除きます。上清(メチル化されていないオルガネラが豊富なDNAが含まれています)を清潔で低結合の2mL微量遠心チューブに移します。このサンプルを-20°Cまたは-80°Cで保存するか、精製のためにステップ3.2.6に直接進んでください。核分画もまた望むならば、MBD2-Fc結合磁性ビーズから核DNAを溶出させるために製造業者の説明書28に従う;ステップ3.2.7で説明したように精製する。精製ビーズが室温で、完全に混合されていることを確認してください。MFキットのマニュアル28の手順に従ってプロトコールを進めてください。注:このサンプルは、NGSライブラリー構築または別の下流解析に使用できるようになりました。480での使用のために設計されており、さまざまな機器および試薬に合わせて調整する必要があります。qPCRが利用できない場合、エンドポイントPCRおよびアガロースゲル上での可視化を、本明細書に記載されたのと同じプライマーおよび条件を使用して、サンプル純度の定性的尺度として使用することができる。プライマーシーケンシングについては表3を参照セックスとペアリング。2μLの10μMフォワードおよびリバースプライマーミックス(0.5μMの最終濃度用)。鋳型2μL(標準曲線の範囲内)。ピペッティング誤差を減らすために、テンプレートを除くすべての反応成分を含むマスターミックスを作製することが好ましい。qPCRプレートにマスターミックスを添加し、目的のテンプレートを各ウェルに添加する。ピペッティングエラーの影響を最小限に抑えるために、各サンプルについて3回の技術的複製を行う必要があります。注:最終的には、核と細胞小器官の定量サイクルの比がサンプル間で比較されるため、濃度のわずかな差は許容されます。DNA濃度はおよそeach。高品質のqPCRシーリング・フィルムでシートをシールします。サンプルを静かにボルテックスし、気泡の発生を避けるよう注意してください。簡単に4°Cで2分間プレートを回転させてサンプルを集め、小さな泡を除去する。プレートを機械にセットします。下記のガイドラインに従ってqPCRプログラムを実行してください。注:これらは、増幅ステージのアニールサイクルを除いて、デフォルトのパラメータです。使用するプライマーが本プロトコールで提示されているプラ​​イマーと異なる場合は、この設定を調整して特定のプライマーに対応させます。sの上昇率でプレインキュベートする。sの上昇率で、(1)95°Cで10秒間45回の増幅サイクルを実施する。sの上昇率((3)で得られたデータ)。sのランプ速度;および97°C、連続取得モード。sのランプ速度で使用してください。アッセイパラメータSYBRテンプレートを選択します。実験ボタンでプログラムのパラメータを確認します。プレートがロードされると、アッセイを開始することができ、アッセイが実行されている間、設定を調整することができる。サンプルエディタを使用してサンプルを割り当てます。Quantをワークフローとして選択し、サンプルを未知、標準、または陰性対照として指定します。レプリケートを指定し、各レプリケートの最初のサンプル名を記入します。濃度と単位を基準に加える。分析のためのサブセットを設定する。これらはサブセットエディタで割り当てられます。外部保存された標準曲線をインポートし(該当する場合)、次に計算を押します。レポートには選択した情報が含まれます。上記の方法から単離されたオルガネラDNA)を代表する標準曲線を使用する。標準曲線を作成するために必要なミトコンドリアDNAの量は、妥当な量の組織で達成するには高すぎるため、ソフトウェアによって提供されるコピー数計算を利用せず、クロスポイント(Cp)値を調べて相対濃縮を決定するサンプル中の核DNAと比較してオルガネラの存在を示している。完全に軽く増殖した2週齢コムギ苗からの全ゲノムDNAの5倍の1:10希釈物に対するプライマーの効率を試験する(代表的な効率は、図2の伝説)。パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)注:このプロトコールは、高分子量DNAを分解するためにPFGEを実施する製造業者のガイドラインに基づいています。材料表を参照してください。ゲルとサンプルの準備ゲルとサンプルの準備に関するガイドラインに従って、利用可能なシステムに合わせてください。6、および120°の夾角。エチジウムブロマイドまたは適切な代替物)でゲルを染色し、適切なゲルドキュメンテーションシステムで画像化する。ngのDNAを使用してください。1回の操作でシーケンシング用のバーコードとサンプルをプールします。製造元のガイドラインに従ってシーケンシングを行います。注:プーリングおよびシーケンシングパラメータは、目的の種、所望のカバレッジレベル、およびライブラリーの配列に使用されるプラットフォームに応じて変更することができます。HiSeqレーンはMiSeqレーンより実質的に多くの出力を有するので、より多くのサンプルを多重化することができる。オルガネラゲノムのカバレッジレベルが下流分析に適しているかどうかを判断するために、サンプルのより小さなサブセットをシーケンスします。31を使用して読み取り品質を調べ、データに必要なトリミングとフィルタリングの程度を判断します。32または他の同等のプログラムを使用して未加工の読み込みをトリムおよびフィルタリングします。sensitiveと設定します。samアラインメントファイルをbam形式(samtools)に変換し、bamファイルをソートします。bamファイルを使用して、ベッドツールでゲノム全体のカバレッジとベースごとのカバレッジを計算します。R-プロット関数を使用して結果を視覚化します。Resultsこの原稿で提示されたプロトコルは、植物組織からオルガネラDNAを富化するための2つの異なる方法を記載している。ここに示した条件は、小麦組織の最適化を反映しています。プロトコルの重要なステップ、必要な組織入力、およびDNA出力の比較を図1に示します。収穫された組織は、新たに処理され、インタクトな細胞小器官を単離するために示差遠心分離および/または勾配に供されなければならない。オルガネラが溶解される前に核DNAが除去され、最後にDNAが抽出され、下流の用途に使用される。対照的に、MFプロトコルでは、使用前に植物組織を採取して保存することができ、完全な細胞小器官は不要である。DNAのメチル化状態。組織入力に関連する全細胞小器官DNA出力に関しては、MFプロトコルは組織が限られている場合に有利であり、単一の植物からの小さな試料を使用することができ、植物をさらなる分析のために増殖させることができる。典型的には、DCプロトコルでは、多くの実生のすべての空中組織が必要であり、これらの植物は廃棄される。DC法は、一方のオルガネラ型を他方のオルガネラ型よりも特に豊富にするように最適化することができ、これはMF法では不可能である。MFのアプローチでは、実習時間が少なくても、各プロトコルの合計時間はほぼ同等であることに言及することは重要です。)の相対的な存在量が測定された。qおよび標的存在量は逆関係。q値および富化レベルについては図2Bを参照)。計算のための図2の凡例参照)。倍率は、それぞれわずか158および10,701である。オルガネラゲノムが核ゲノム37よりも細胞当たりより大きなコピー数で存在すること、および細胞小器官の数が存在することを考えると、全ゲノムDNA中の核アンプリコンに比べてオルガネラアンプリコンの存在度が高いことを見出すことは驚くことではないR細胞は、組織タイプまたは発生段階38、39に応じて異なっていてもよいです。全体として、このデータは、遠心分離速度がミトコンドリアを選択的に単離し、核および葉緑体の「汚染」を低減するために最適化されるので、DC法がミトコンドリアを優先的に濃縮することを示している。MF総gDNAの非メチル化画分も、オルガネラアンプリコンの両方の実質的な濃縮を示し、これらの標的の天然の相対量を保持すると予想される。indiMBD2-Fcタンパク質がメチル化核DNAのプルダウンで非常に効率的であると述べている。6Cq早期)サンプルにおいてミトコンドリアアンプリコンよりも豊富に存在するので、これは、これらのアンプリコンの天然の存在量は、MDB2プルダウンによって実質的に変化しない。我々は、これらのゲノムを特異的に配列決定することに興味があるため、ここでは非メチル化(オルガネラ)画分に焦点を当てる。核ゲノムが主要な関心事である場合、MFおよびその後のメチル化画分のシーケンシングは、オルガネラDNAの「汚染」の減少のために、全ゲノムDNA配列決定よりもはるかに高い核ゲノムカバレッジをもたらす。qPCRが利用可能でない場合、エンドポイントPCR(qPCRと同じプライマーを使用する)が品質を提供することは注目に値するオルガネラの純度の評価。