髄液は脳周囲を循環する体液であり、神経系マーカーの宝庫と考えられている。我々は、髄液中にユニークな糖鎖(脳型糖鎖)を持つ一群の糖タンパク質を見いだした。その一つにα2マクログロブリン(α2M)がある。α2Mは生理的なプロテアーゼ・インヒビターであり、けいれん性疾患での変化が予想された。Fs)群の2つに分別し、α2Mによる鑑別の可能性を検討した。平成27年度には症例数を増やし、AEE・15例およびFs・24例の試料を収集した。従って、α2MはAEEのマーカーになることが示された。この事実は、髄液中α2Mの変化は血清α2Mとは独立した制御を受けることを示している。ウェスタンブロットによる定量は、時間と手間がかかることから、サンドイッチELISA系の構築を行なった。ng/mLの範囲で直線性を示す検量線が得られた。この実験系によりハイスループットのアッセイが可能となった。本研究の目的は、重症疾患であるAEEと軽症疾患であるFsのマーカー探索である。平成27年度の結果は髄液中α2Mが両病態の鑑別疾患マーカーになることを示している。従来バイオマーカーがなかった脳症の早期診断により、患者の救命につながることが期待される。AEEとFsではα2Mの濃度が髄液中では有意に異なるのに対し、血清濃度は両者で差が認められなかった。この事実は、髄液と血清のα2Mが独立した制御を受けていることを示唆している。診断には髄液採取が必須であることを示している。従来、α2Mの測定はウェスタンブロット法で行なっていた。この方法は時間と手間がかかるため、臨床応用は難しかった。平成27年度に我々はサンドイッチELISA法によるα2Mの測定系を構築した。これは、臨床応用に結びつく成果であると考えている。我々は、AEEとFsの間で髄液中α2Mの有意差を示した。診断の感度・特異度は十分とは言えない。この理由は、髄液中には血清由来のα2Mが混入しており、脳内で作られるα2M(真のマーカー)と区別されないためと考えている。両α2Mは、タンパク質部分は同一であるが、糖鎖修飾が異なっている(血清型α2Mおよび脳型α2M)。糖鎖修飾の違いを検出すれば両アイソフォームを個別に定量することが可能となる。これによって、診断の感度・特異度の上昇が期待される。糖鎖アイソフォームを区別する具体的な方法は、“レクチン/抗体サンドイッチELISA法”である。この方法では、糖鎖認識分子であるレクチンを使って、アイソフォームを区別する。脳型糖鎖を認識するレクチンをマイクロタイタープレート上にコートし、脳型α2Mを捕捉する。この時、血清型α2Mは捕捉されずに洗浄除去される。洗浄操作の後、捕捉された脳型α2Mを抗体にて検出する。これによって脳型α2Mを特異的に測定することが可能である。平成27年度の研究成果により、AEEで増加するα2Mは脳内で生合成されることが示唆された。これを実証するために、抗α2M抗体を使った免疫組織化学を予定していた。ヒト脳炎の組織の入手ができなかったため、組織学的研究は行なえなかった。このため、次年度使用額が生じた。病理学講座を予定していた。平成28年度は他施設からの脳炎組織を入手を予定してあまおり、組織学的検討を行う予定である。