vitroで大きく増強させることが見出された。vivo拡大ののちにどのようにSTRO-1bri発現細胞の割合を増強させたかの機構を調査するために、方法に記載したように培養したStro-1briをCFSEで標識し、その後、様々な因子に曝した。図10は、方法に記載したようにIL-1βがCFSEで標識したMPCの増殖能力を増加させた代表的な実験を示す。mAbで染色し、上述のように解析した。IL-1βは、明STRO-1+骨前駆細胞の数を増加させることによってMPCの分裂の数を増強させることが見出された。1,25D、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β、およびSDF-1αを用いてMPCを刺激した場合にも同様の結果が得られた。実施例5:Stro-1bri細胞の増殖の増大はStro-1dim細胞の数も増加させる様々な因子の存在下でSTRO-1bri培養MPCの割合を増強させる能力は、Stro-1dim細胞数の増加とも相関していた。したがって、本発明者らは、この表現型の変化も誘導したSTRO-1briMPCが骨形成細胞である骨芽細胞へと分化する能力の増大と相関していたかどうかを検査した。図11は、IL-1βはSTRO-1陽性MPCの増殖を刺激しただけでなく、骨誘導剤であるデキサメタゾンの存在下でその骨形成能力も増強したことを示している。0.01ng/mlの濃度のIL-1βは、未処理の対照培養物のMPC数を136.6±1.2%まで有意に増加させた(図11A)。0.1ng/mlを超える濃度でプラトーな効果が得られた。vivoで拡大させたMPCの子孫を骨誘導条件の存在下で24ウェルプレートに播種した。カルシウム濃度を方法に従って決定した。結果により、未処理の細胞と比較して(図11B)IL-1βで処理した細胞において鉱物堆積が増加していたことが示された(図11C)。4週間目および6週間目のどちらにおいても、IL-1βで処理した細胞中のカルシウムレベルは未処理の細胞のそれよりも有意に高かった。vitroで増強されたことを示唆している。vivoでさらに試験した。vivoで拡大させたSTRO-1briMPCの数を増強させることが知られているさらなる因子であるPDGF-BB(10ng/ml)を存在させてまたは存在させずに培養した(図9C参照)。方法に記載したように、PDGFで誘導した細胞調製物および誘導していない細胞調製物を、免疫無防備状態のマウス内に、ハイドロキシアパタイト/リン酸三カルシウム粒子(HA/TCP)と共に同時移植した。Imagingによって定量することで(図13A)、PDGF-BBで前処理した培養物(図13C)は、未処理の対照培養物(図13B)と比較して有意に異所性の高い骨形成を示すことが示された。2003)(図14A)。それぞれの分別したSTRO-1集団について、全RNAを5人の個別の骨髄ドナーから調製してプールした。第一鎖の合成に次いで、STRO-1brightおよびSTRO-1dullcDNAを「材料および方法」に記載のように一連のサブトラクションハイブリダイゼーションステップに供した。STRO-1brightBMSSC集団によって独自に発現される遺伝子を同定するために、STRO-1brightのサブトラクションを行ったcDNAを用いて、T/Aクローニングベクター内にライゲーションしたSTRO-1brightのサブトラクションを行ったcDNAで形質転換させた200個の無作為に選択した細菌クローンを含む、複製低密度マイクロアレイフィルターを構築した。マイクロアレイを、[32P]dCTPで標識したSTRO-1brightまたはSTRO-1dullのサブトラクションを行ったcDNAのどちらかでプロービングを行った(図14B〜C)。示差的スクリーニングにより合計44個のクローンが同定され、これらはSTRO-1dullおよびSTRO-1bright部分集団の間で高度に示差的に発現されていた。興味深いことに44個のクローンのうち6個が、ケモカインの間質由来因子-1(SDF-1)に対応するDNA挿入物を含むことが判明した。ヒトBMSSCにおけるSDF-1転写物の高い存在度は、新鮮に分別したSTRO-1bright、STRO-1dull、およびSTRO-1negative骨髄部分集団から調製した全RNAの半定量的RT-PCRによって確認された(図14D)。vitroにおいてBMSSCの発生学的段階に関連しているかどうかを検査した。STRO-1/AP部分画分を分配した。99.9%を超える純度を得るためにそれぞれのSTRO-1/AP部分画分を二重に分別した。SDF-1発現を検査する半定量的RT-PCRを、それぞれのSTRO-1/AP分別集団から単離した全RNAで行った。解析により、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して正規化した場合、最も未熟な間質集団STRO-1+/AP-(骨前駆体)、次いでSTRO-1+/AP+(前骨芽細胞)が、最も成熟した細胞集団STRO-1-/AP+(骨芽細胞)およびSTRO-1-/AP-(骨細胞、骨裏打ち細胞)と比較して、SDF-1をより高いレベルで発現したことが明らかとなった(図15B)。平行した実験では、骨形成誘導培地(L-アスコルビン酸-2-リン酸、デキサメタゾン、および無機リン酸塩を添加)を添加したBMSSCの二次培養物は、時間依存的な様式でSDF-1発現の低下を示した(図16A)。データにより、骨形成誘導培地を用いた48時間の刺激ののちに、より低いSDF-1発現レベルがより高い割合の前骨芽細胞様細胞(STRO-1+/AP+)に関連していることが明らかとなった(図16B)。実施例8:BMSSCはSDF-1受容体、CXCR4を発現するSDF-1が自己分泌因子として作用できるかどうかを決定するために、RT-PCR解析を用いた予備実験により、BMSSCが実際にSDF-1受容体、CXCR4を発現することが確認された(図17A)。正常な培養BMSSCおよびヒト骨肉腫細胞系MG63のCXCR4発現の検査により、予測された568塩基対のPCR産物および第2のより大きなバンドの様々な発現が明らかとなった。フローサイトメトリー解析によって示されるように、BMSSCは低レベルのCXCR4タンパク質を細胞表面で構成的に発現することも示されている(図17B)。BMSSCによって発現されたCXCR4が機能的に活性を有するかどうかを決定するためにカルシウム流動研究を実施した。FURA-2を負荷したBMSSCに30ng/mLの組換えヒトSDF-1α(rhSDF-1α)を与え、その結果、SDF-1/CXCR4シグナル伝達に特徴的な細胞内カルシウムレベルの迅速かつ頑強な増加がもたらされた(図17C)。cDNAを含むレトロウイルス発現構築体を用いてパッケージング細胞系PT67への導入を行った。その後、感染性粒子を含む収集した上清を用いて高レベルのSDF-1αを発現する安定した複数コロニー由来BMSSC細胞系を産生し、対応する対照細胞系を空のpLNCX2ベクターで形質導入した(図18A)。【0220】3つの個別の骨髄吸引液に由来する細胞系を、免疫無防備状態のマウス内に、「材料および方法」に記載のようにハイドロキシアパタイト/リン酸三カルシウム粒子と組み合わせて移植した。Imaging解析により、高SDF-1発現性BMSSC系を含む移植片において、ベクター対照と比較して有意に高い面積あたりの異所性骨形成レベル(P<0.05、t検定)が示された(図18C)。観察されたSDF-1媒介性の増強された骨形成能力の潜在的な機構を同定するために平行した研究を行った。vitroで形成する、ベクター対照細胞系を超える能力において、統計的差異を検出することができなかった(データ示さず)。本発明者らは、様々な骨関連遺伝子(BMP2、BMP4、CBFA1、オステリックス、オステオカルシン、アルカリホスファターゼ[AP])の発現において、高SDF-1発現性BMSSC系と一致したベクター対照BMSSC系との間に一貫した差異を検出することができなかった(データ示さず)。vivoで骨形成に間接的な効果を与えたことを示唆している。実施例10:SDF-1はBMSSCの成長および生存を媒介する本発明者ら次に、SDF-1の過剰発現が形質導入したBMSSCに有利な成長または生存をもたらし得る可能性を検査した。この概念は、高SDF-1発現性BMSSCが、その成長能力においてBMSSCベクター対照細胞系を超える、中等度であるが顕著ではない増大を示したことを実証する増殖研究によって支持されている(図19A)。1995)炎症性サイトカインIL-4のアポトーシス誘導効果に対してより高い耐性も示し、これはトリパンブルー取込み法によって評価した(図19B)。これらの発見に従って、SDF-1を過剰発現するBMSSCの生培養物では、IL-4を与えた場合に、初期アポトーシスマーカーであるアネキシンVの細胞表面染色の低下も示された(図19C〜D)。正常なBMSSCの成長に対する外来SDF-1の効果を決定するために比較実験を行った。外来rhSDF-1αは、単独ではコロニー産生を刺激する固有の能力を示さなかったが、PDGF-BBと組み合わせるとCFU-F数の増加が観察された(図20)。1992)、PDGF-BB誘導性コロニー形成の典型的な減少が実証され、これはSDF-1の存在下で部分的に可逆的であることが示された。SDF-1の存在下における観察された応答は、0.1〜100ng/mLの濃度範囲にわたって30ng/mLで最適であることが判明した(図21)。まとめると、これらのデータは、SDF-1がBMSSCの自己複製および生存能力の促進において役割を果たすことを示唆している。本研究は、ヒト骨髄吸引液から直接単離した最も初期の検出可能なBMSSCが、培養前にSDF-1を高レベルで発現することを初めて実証した。