vivoで増殖させたBMSSC集団を骨再生のために使用する可能性の調査を促進した。このような研究の進行は、ヒト分化多能性BMSSCの成長および生存ならびにこれらの細胞が最終的に骨へと発達することを調節する重要な因子の理解の欠如が原因で、大部分が制限されている。本発明者らは今回、SDF-1を、培養前に精製したBMSSCによって高度に発現されている、示差的に発現される遺伝子として同定した。vitroで培養した未熟な前骨形成細胞が、骨芽細胞および骨細胞/骨裏打ち細胞が代表的である成熟細胞種と比較した場合に、SDF-1をより高いレベルで発現したことを見出した。SDF-1の発現はBMSSCを骨誘導条件下で培養した場合に迅速にダウンレギュレーションされた。【0010】BMSSCは、機能的な細胞表面SDF-1受容体(CXCR4)を発現することも示されている。vivoで異所性の骨を形成する能力の増強を示した。SDF-1を高度に発現するBMSSCは、細胞の成長およびインターロイキン-4誘導性アポトーシスに対する保護の能力の増加を示した。BB(PDGF-BB)およびSDF-1と相乗作用して、成長の増加およびα-インターフェロン-2a誘導性アポトーシスに対する耐性を示した。【0011】これらの発見は、ケモカインSDF-1が未熟BMSSC集団の増殖、生存、および骨形成能力において役割を果たすことを示している。【0012】したがって、本発明は、間葉系前駆細胞(MPC)もしくは子孫をSDF-1またはその類似体に曝すことを含む、MPCもしくはそれに由来する子孫の増殖および/または生存を増強させる方法を提供する。発生させる方法も提供する。本発明はまた、SDF-1またはその類似体を過剰発現するように遺伝子改変した、MPCまたはそれに由来する前駆細胞も提供する。本発明はまた、本発明の遺伝子導入されたMPC集団を含む組成物も提供する。本発明はまた、MPCまたはそれに由来する子孫およびSDF-1またはその類似体を含む組成物も提供する。本発明はまた、対象中のMPCもしくはそれに由来する子孫を外来SDF-1またはその類似体に曝すことを含む、対象において骨を産生する方法も提供する。本発明はまた、本発明の組成物を対象に、所望の骨産生部位で投与することを含む、対象において骨を産生する方法も提供する。【図1−1】培養したMPCに由来するSTRO-1briまたはSTRO-1dim発現細胞の遺伝子発現プロフィールを示す図である。vivoで拡大させた骨髄MPCの単細胞懸濁液をトリプシン/EDTA処理によって調製した。STRO-1抗体を用いて細胞を染色し、次いでこれをヤギ-抗ネズミIgM-フルオレセインイソチオシアネートと共にインキュベーションすることによって表示させた。後のSTRO-1dimまたはSTRO-1bri発現細胞の精製した集団から調製した(A)。RNAzolB抽出方法、および標準の手順を用いて、全RNAを各部分集団から単離し、cDNA合成の鋳型として用いた。1.5%アガロースゲル電気泳動によって解析し、臭化エチジウム染色によって可視化した(B)。【図1−2】ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHの発現を参照として、ImageQantソフトウェアを用いて、それぞれの細胞マーカーの相対的な遺伝子発現を評価した(C)。vivoで拡大させた細胞の免疫形質発現パターンを示す図である。vivoで拡大させた細胞の単細胞懸濁液をトリプシン/EDTA処理によって調製し、次いで、広範な細胞系統関連マーカーを同定する抗体と組み合わせたSTRO-1抗体と共にインキュベーションを行った。STRO-1はヤギ抗ネズミIgM-フルオレセインイソチオシアネートを用いて同定したが、すべての他のマーカーはヤギ抗マウスまたは抗ウサギIgG-フィコエリスリンのどちらかを用いて同定した。細胞内抗原を同定する抗体では、細胞調製物をまずSTRO-1抗体で標識し、冷70%のエタノールで固定して細胞膜の透過処理を行い、その後、細胞内抗原に特異的な抗体と共にインキュベーションを行った。アイソタイプが一致した対照抗体を同一条件下で用いた。EPICSフローサイトメーターを用いて2色フローサイトメトリー解析を行い、リストモードのデータを収集した。ドットプロットは5,000回のリストモードの事象を表し、これは、各系統の細胞マーカーの蛍光強度レベル(y軸)およびSTRO-1(x軸の)を示す。垂直および水平の象限は、アイソタイプが一致した陰性対照抗体を参照として確立した。vivoで拡大させた細胞の免疫形質発現パターンを示す図である(図2の続き)。vivoで拡大させた細胞の免疫形質発現パターンを示す図である(図2の続き)。vivoで拡大させた細胞の免疫形質発現パターンを示す図である(図2の続き)。vivoで拡大させた細胞の免疫形質発現パターンを示す図である(図2の続き)。vitroでの脂肪生成の発達を示す図である。vivoで拡大させた細胞の二次培養物から、STRO-1bri/VCAM-1+分別骨髄細胞に由来するトリプシン/EDTA消化によって作製した。用いて、そのSTRO-1の発現に従って、拡大させた細胞を単離した。その後、STRO-1briおよびSTRO-1dim分別MPCに由来する細胞を、終夜、6ウェルプレート内に、1×105個の細胞/ウェルの密度、通常の増殖培地下で植え付けた。翌日、方法に記載したように培地を脂肪生成誘導培地で置き換えた。その後、週に2回、合計3週間の期間、培養物に培地を与え、その後、細胞を固定してオイルレッドOで染色した。接着間質層全体にわたって散乱した脂肪細胞を含む脂質のオイルレッドO染色を表した低倍率拡大(4×)および高倍率拡大(20×)を示す。STRO-1dim培養物における7±2個の脂肪細胞(単位面積あたり、20×、n=9の視野)と比較した場合、STRO-1bri培養物において平均して22±5個のオイルレッドO陽性脂肪細胞が同定された(単位面積あたり、20×、n=9の視野)。vitroにおける骨形成の発達を示す図である。vivoで拡大させた細胞の二次培養物からのトリプシン/EDTA消化によって作製した。(FACS)を用いて、拡大させた細胞をそのSTRO-1の発現に従って単離した。その後、STRO-1briおよびSTRO-1dimFACS単離細胞を終夜、48ウェルプレート内に、0.3×105個の細胞/ウェルの密度、通常の増殖培地下で植え付けた(1条件あたり4つの同型)。翌日、方法に記載したように培地を骨形成誘導培地で置き換えた。その後、週に2回、合計3週間の期間、培養物に培地を与え、その後、細胞を洗浄し、0.6NのHCLで処理して石灰化した堆積物内のカルシウムを抽出した。試料をo-クレゾール-フタレイン-コンプレキソンと反応させ、比色反応を570nmで読み取った。絶対カルシウム濃度は、カルシウムの検量線に従って決定した。(A)カルシウム測定により、STRO-1dim培養物と比較した場合にSTRO-1bri培養物が有意により多くの鉱物合成したことが示された(*;p<0.05;t検定)。同型培養物を固定し、アリザリンレッド染色について染色を行い、これは、STRO-1bri(B)およびSTRO-1dim(C)培養物の接着層中の石灰化した堆積物の典型的なレベルを表す。vitroにおける軟骨形成の発達を示す図である。vivoで拡大させた細胞の二次培養物からのトリプシン/EDTA消化によって作製した。(FACS)を用いて、拡大させた細胞をそのSTRO-1の発現に従って単離した。その後、週に2回、合計3週間の期間、培養物に培地を与えた。細胞ペレットを回収し、方法に記載したように組織学的な検査または全RNAの調製用に用いた。STRO-1bri(A)およびSTRO-1dim(B)細胞集団はどちらも、軟骨細胞様細胞を含む細胞ペレットを形成する能力を有していた。RT-PCR解析により、STRO-1bri(SB)集団は、STRO-1dim(SD)細胞集団(C)と比較した場合に、より高いレベルの軟骨関連遺伝子X型コラーゲンおよびアグリカンを表示することが示された。【図6】STRO-1Bri細胞がSTRO-1dim細胞の増殖を誘発させることを示す図である。vivoで拡大させた骨髄MPCの単細胞懸濁液をトリプシン/EDTA処理によって調製した。細胞をSTRO-1抗体で染色し、図1に記載のようにSTRO-1dimまたはSTRO-1briを発現する培養細胞集団の集団へと分別した。方法に記載したように細胞をCFSEで標識した。未標識細胞を用いて陰性対照(自己蛍光)を確立した。Colcemid(登録商標)(100ng/ml)を用いて細胞分裂を阻害して入力標識指数(産生0)を提供した。以下の比で未標識STRO-1brightをCFSE標識したSTRO-1dim細胞に加えた:(A)0個のSTRO-1bri細胞:1×105個のSTRO-1dim細胞(0%);(B)0.05×105個のSTRO-1bri細胞:0.95×105個のSTRO-1dim細胞(5%);(C)0.1×105個のSTRO-1bri細胞:0.9×105個のSTRO-1dim細胞(10%);(D)0.2×105個のSTRO-1bri細胞:0.8×105個のSTRO-1dim細胞(20%);(E)0.5×105個のSTRO-1bri細胞:0.5×105個のSTRO-1dim細胞(50%)。添加混合物を7日間の間培養し、収集し、方法に記載したようにフローサイトメトリーによって解析した。LT(バージョン2.0)を用いて解析した。STRO-1bri細胞(R1)はSTRO-1dim細胞の増殖を用量依存的な様式で刺激することが見出された。【図7】サイトカインおよび骨向性剤は培養物中のSTRO-1bri細胞の数を増加させることを示す図である。mAbで染色し、上述のように解析した。これらの因子はSTRO-1briMPCの数を増加させることが見出された。示した結果は3つの独立した実験の代表的な例である。【図8】左前下行枝(LAD)冠状動脈の結紮を行い、48時間後に生理食塩水、1×106個のヒトStro-1dim細胞、1×106個のヒトStro-1bri細胞または1×106個のヒトStro-1-除去骨髄単核細胞を注射した無胸腺症ヌードラットを示す図である。2週間後、動物を屠殺し、心臓組織を固定して2つのモノクローナル抗体で同時に染色した:1つ目はラットと選択的に反応性を有するがヒトのKi67抗原との反応性は有さず、2つ目は心筋細胞マーカーのトロポニンIと反応性を有する。増殖中のラット心筋細胞の指標である二重に染色された細胞は、免疫ペルオキシダーゼ技術によって検出した。生理食塩水または1×106個のStro-1dimヒト細胞を受ける対照動物と比較して、1×106個のStro-1briヒト細胞を受ける動物は、2.5〜5倍高い数の増殖中のラット心筋細胞を示した(p<0.05)。皮下注射した図である。2週間後、ラットに生理食塩水、0.5×106個のヒトStro-1dim細胞または0.5×106個のヒトStro-1bri細胞の腫瘍内注射を与えた。1週間後、動物を屠殺し、腫瘍組織を固定して2つのモノクローナル抗体で同時に染色した:1つ目は平滑筋細胞によって発現されるα-平滑筋アクチン抗原と反応性を有し、2つ目は血管内皮細胞によって発現されるvWF抗原と反応性を有する。内皮および平滑筋をどちらも含む細動脈ならびに動脈の指標である二重に染色された構造は、免疫ペルオキシダーゼ技術によって検出した。0.5×106個のStro-1briヒト細胞を受ける動物は、腫瘍内の細胞注射部位において生理食塩水または1×106個のStro-1dimヒト細胞を受ける対照動物と比較して、3.5〜8倍高い数の細動脈および動脈を示した(p<0.05)。ヒト細胞を注射した位置から遠位の部位では差異が見られなかった。【図10】IL-1βがMPCから拡大させた細胞の増殖能力を増大させることを示す図である。方法に記載したように細胞をCFSEで標識した。mAb染色し、上述のように解析した。(A)未処理(NT)および(B)IL-1βで処理した培養物は、STRO-1bri/ALP陽性細胞の数の増加を示す。このSTRO-1発現の増加には、未処理の培養物が4回の細胞分裂を受けた際に(C)に示す細胞増殖の増加が伴い、一方で(D)IL-1βで処理した培養物はSTRO-1bri骨前駆細胞の数を増加させることによって細胞分裂数の増加を示す。示した結果は3つの独立した実験の代表的な例である。1,25D、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β、およびSDF-1αを用いてMPCを刺激した場合にも同様の結果が得られた。【図11】IL-1βがMPCの増殖を刺激し、骨誘導剤であるデキサメタゾンの存在下でその骨形成能力も増強することを示す図である。vivoで拡大させたMPCの子孫を96ウェルプレートに、2,000個の細胞/ウェルの細胞密度で播種し、α-MEM-10中で培養した。培養物に示した濃度のIL-1βを添加し、方法に記載したように7日目にWST-1を用いて細胞数および生存度を定量した。0.01ng/mlの濃度のIL-1βは、未処理の対照培養物の136.6±1.2%まで細胞数を有意に増加させた(D、P=0.000003、スチューデントt検定)。0.1ng/mlを超える濃度でプラトーな効果が得られた。値は、各濃度の3つ組培養物の平均±SEMを表す。vivoで拡大させたMPCの子孫を24ウェルプレートに5×104個/ウェルの細胞密度、3つ組で播種し、方法に記載したように骨誘導条件で培養した。細胞を10ng/mlの濃度のIL-1βで処理し、培養物に週1回、IL-1βを含む新鮮な培地を「与えた」。マトリックスからの遊離カルシウムの放出は、方法に記載したように接着細胞層を酸性条件下で処理することによって達成された。試料をo-クレゾール-フタレイン-コンプレキソンと反応させ、比色反応を570nmで読み取った。絶対カルシウム濃度は、カルシウムの検量線に従って決定した。結果により、未処理の細胞(B)と比較してIL-1βで処理した細胞(C)において鉱物堆積が増加していたことが示された。IL-1βで処理した細胞中のカルシウムレベルは、4週間目(**P=0.00009、スチューデントt検定)および6週間目(**P=0.00004、スチューデントt検定)(D)のどちらにおいても、未処理の細胞のそれよりも有意に高かった。示した結果は、3人の異なるドナー由来の間質細胞を、用いた3つの独立した実験の代表的な例である。【図12】IL-1βが増殖およびSTRO-1briMPCを刺激し、一方でデキサメタゾンはアルカリホスファターゼ(ALP)発現を誘発させる図である。ヒトMPCの確立した培養物を、24ウェルプレートに、3×104個/ウェルの細胞密度で、(A)添加なし(NT)、(B)10ng/mlのIL-1βまたは(C)1×10-8Mのデキサメタゾンならびに(D)10ng/mlのIL-1βおよび1×10-8Mのデキサメタゾンを添加した完全培地中で播種した。方法に記載したように細胞を21日間培養した。結果は、IL-1βの分裂促進的作用がSTRO-1briMPCの数を増加させる役割を果たし(B)、立ち代ってこれがSTRO-1dim細胞の増殖を刺激することを示唆している(図6参照)。MPCは、増殖培地中に存在するFCSおよびアスコルビン酸-2-リン酸に応答してALPの発現を獲得し、これは副腎皮質ステロイドであるデキサメタゾン(dex)に応答して増強される(D)。IL-1βおよびdexの合わせた作用が、図11に見られるように骨形成を増強させる役割を果たす。実験は3回行い、3人の異なるドナー由来のMPCで同様の傾向が観察された。vivoにおける骨形成に対するPDGFの効果を示す図である。vivoで拡大させた細胞の半コンフルエントな二次培養物を、PDGF-BB(10ng/ml)を存在させてまたは存在させずに5日間培養した。トリプシン/EDTA消化によって単細胞懸濁液を作製し、その後、40mgのハイドロキシアパタイト/リン酸三カルシウム粒子(HA/TCP)と共にインキュベーションを行い、方法に記載したように免疫無防備状態のマウス内に移植した。8週間後、収集した移植片を固定し、組織学的検査用に処理した。Imagingソフトウェアを用いて、3つの同型移植からの表面積(20×)で決定した(A)。PDGF-BBで前処理した培養物は、未処理の対照培養物と比較して、有意に(*;p<0.05;t検定)より異所性の高い骨形成を示すことが示された。未処理(B)およびPDGFで処理した(C)移植片のヘマトキシリン/エオシン染色した異所性骨の断面図を表す典型的なイメージを示す。【図14】BMSSCは高レベルのSDF-1を発現することを示す図である。(A)MACSで単離したSTRO-1+BMMNCの調製物を、FACSを用いて領域、すなわちSTRO-1briおよびSTRO-1dullに従って様々なSTRO-1部分組へと分配した。それぞれのSTRO-1部分集団から全RNAを調製し、これを用いて「材料および方法」に記載のようにSTRO-1briサブトラクションハイブリダイゼーションライブラリーを構築した。(B〜C)STRO-1briのサブトラクションを行ったcDNAで形質転換させた細菌クローンから増幅した代表的なPCR産物をブロッティングした、複製ニトロセルロースフィルターを示す図である。その後、[32P]デオキシシチジン三リン酸(dCTP)で標識したSTRO-1bri(B)またはSTRO-1dull(C)のサブトラクションを行ったcDNAのどちらかを用いて、フィルターのプロービングを行った。矢印は、ヒトSDF-1に対応するcDNA断片を含む1つのクローンの示差的発現を示す。STRO-1集団から調製した全RNA中のSDF-1およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)転写物の相対的な発現を実証する逆転写酵素(RT)-PCR解析である。【図15】未熟なBMSSCはより成熟した集団よりもSDF-1を高いレベル発現することを示す図である。vivoで増殖させたBMSSCの単種細胞懸濁液の二重フローサイトメトリー解析を表す。分別した様々なSTRO-1/AP部分集団は、分別領域R1、R2、R3、およびR4に応じてFACSによって単離した。(B)グラフは、分別していない、そのSTRO-1およびAPの細胞表面発現に応じてFACSで単離した培養BMSSC集団から調製した全RNAにおける、ハウスキーピング遺伝子GAPDHと比較したSDF-1の相対的な発現の半定量的RT-PCR解析を示す。未熟な骨形成前駆体集団(STRO-1+/AP-)が前骨芽細胞(STRO-1+/AP+)よりも高いレベルで発現され、次いでより成熟した骨芽細胞(STRO-1-/AP+)および骨細胞(STRO-1-/AP-)集団であった。データは、2人の異なる健康な骨髄ドナーから確立した二次BMSSC培養物を用いた、2つの独立した実験の平均値±標準誤差を表す。【図16】SDF-1は骨誘導後にBMSSCによってダウンレギュレーションされることを示す図である。する対照は、各時点において有意値(*)P<0.05を用いた対応のあるt検定を使用して解析した。vivoで増殖させたBMSSCの単種細胞懸濁液の2色フローサイトメトリー解析を表す。【図17】BMSSCが機能的SDF-1受容体を発現することを示す図である。(A)初代BMSSC培養物またはヒト骨肉腫細胞系であるMG63のどちらかから単離した全RNA中における、CXCR4およびGAPDH転写物の相対的な発現を実証するRT-PCR解析である。(B)培養BMSSCの単種細胞懸濁液を、マウス抗ヒトCXCR4抗体またはアイソタイプが一致した対照抗体である1A6.11のどちらかと共に、次いでヤギ抗マウスIgG1FITCコンジュゲート抗体と共にインキュベーションを行った。代表的なヒストグラムは、フローサイトメトリー解析によって評価した、対照試料(点線)に対するBMSSCによるCXCR4(実線)の細胞表面発現レベルを示す。(C)このグラフは、ヒト組換えSDF-1α(30ng/mL)を加えた後の、初代BMSSC培養物中で経時的に測定した細胞内カルシウムのレベルを実証している。【図18】BMSSCによるSDF-1の強制発現がその骨形成能力を増強させることを示す図である。cDNAまたはベクター単独のどちらかを含むpLNCX2構築体を用いて、3つの異なる骨髄吸引液に由来する二次BMSSC培養物の形質導入を行った。安定した複数コロニー由来の高SDF-1発現性BMSSCおよび対応する対照系をG418選択後に作製した。市販のELISAキットを用いて、組織培養物上清の3つ組試料をSDF-1αレベルについて評価した。データは、3つの異なる高SDF-1発現性BMSSC細胞系対対応する対照から作成した平均値±標準誤差を表す。(B)形質導入したBMSSC系のそれぞれの単種細胞懸濁液をハイドロキシアパタイト(HA/TCP)粒子と混合し、その後、NOD/SCIDマウスの皮下に移植した。イメージは、ヘマトキシリン&エオシンで染色した、高SDF-1発現性BMSSC(SDF-1)および対照細胞系(LNCX2)によって形成された新しい骨(b)の8週齢の収集した移植片の断面図を表す(×200)。BX50光学顕微鏡(Olympus、東京)でキャプチャーした。(C)各グラフは、様々な高SDF-1発現性BMSSC系および3人の異なる骨髄ドナーに由来する対応する対照細胞系を表す。Imagingソフトウェアを用いて12個の代表的な組織切片から解析した全組織の表面積の割合として表す。データは2つ組の移植片からの平均値±標準誤差を表す。SDF-1高発現性BMSSC系と対応する対照との間の統計的差異(*)P<0.05は、対応のないt検定を用いて決定した。【図19】BMSSCによるSDF-1の強制発現が細胞の生存を向上させることを示す図である。(A)高SDF-1発現性BMSSCおよびベクター対照細胞系を3つ組ウェル中に、5×103個の細胞/ウェルの密度で、96ウェルプレート、通常の増殖培地中、5日間植え付けることによって、増殖の研究を行った。その後、トリプシン/EDTA消化によって単種細胞懸濁液を調製し、細胞の全数を評価するために計数した。(B)インターロイキン4(IL-4;30ng/mL)の存在下で平行した培養物を確立し、トリパンブルー排除を用いることによってアポトーシス細胞の割合を測定した。(C)このヒストグラムは、IL-4の存在下で培養したアイソタイプが一致した対照抗体(点線)と比較した、対照細胞系による細胞表面アネキシンV染色のレベル(実線)を表す。situ蛍光染色の強度の代表的なイメージを示す(×100)。(D)このヒストグラムは、IL-4の存在下で培養したアイソタイプが一致した対照(点線)と比較した、高SDF-1発現性BMSSC系による細胞表面アネキシンV染色のレベル(実線)を表す。situ蛍光染色の強度の代表的なイメージを示す(×100)。データは、3つ組の実験の平均値±標準誤差を表す。SDF-1高発現性BMSSC系と対応する対照との間の統計的差異(*)P<0.05は、対応のないt検定を用いて決定した。【図20】SDF-1がCFU-Fの成長および生存を促進することを示す図である。様々なサイトカインの組合せの存在下で無血清培地中に植え付けた、MACS/FACSで単離したSTRO-1briBMMNCに由来する、CFU-Fコロニーの全数を数えた。組換えヒトPDGF-BB、SDF-1α、およびα-インターフェロン2aを、それぞれ最適濃度5ng/mL、30000IU/mL、および30ng/mLで用いた。データは、3つ組のウェルの平均値±標準誤差を表す。3つの異なる骨髄吸引液を用いることによって同様の結果が得られた。統計的有意性(P<0.01)は、すべての処理において一方向ANOVAを用いることによって決定した。その後、フィッシャー試験を用いてすべてのグループ間の差異を決定した。PDGF-BB単独(*)と比較してすべての処理間で、およびPDGF+IFN(インターフェロン)対PDGF+SDF-1+IFN(**)において有意度P<0.05で、有意な差異(P<0.05)が判明した。【図21】SDF-1がIFN-αのアポトーシス効果に対して、用量依存的の様式でCFU-F形成を保護することを示す図である。MACSで選択したヒト骨髄単核細胞を、PDGF(5ng/ml)単独またはPDGFおよびIFN-α(30,000i.u./ml)またはPDGFおよびIFN-αおよびSDF-1(0.1〜100ng/ml)のいずれかの存在下で、血清除去培地中に植え付けた。14日間の培養ののち、プレートを固定し、CFU-Fコロニーの計数方法に記載したように染色した。本発明者らは、ケモカインSDF-1が未熟なBMSSC集団の増殖、生存、および骨形成能力に役割を果たすという驚くべき発見を行った。【0020】したがって、本発明は、MPCもしくは子孫をSDF-1またはその類似体に曝すことを含む、間葉系前駆細胞(MPC)もしくはそれに由来する子孫の増殖および/または生存を増強させる方法を提供する。本明細書中で使用するMPCとは、多数の分化多能性細胞コロニーを形成する能力を有する非造血性前駆細胞である。本発明の好ましい例では、MPCは、STRO-1bright、VCAM-1bright、THY-1bright、CD146brightおよびSTRO-2brightからなる群から選択される少なくとも1つのマーカーについて陽性である。本明細書中で使用する用語「bright」とは、検出可能に標識した場合に比較的高いシグナルが生じる細胞表面上のマーカーをいう。理論に限定されることを望まないが、「明」細胞は、試料中の他の細胞よりも標的マーカータンパク質(たとえばSTRO-1によって認識される抗原)を多く発現すると提案されている。FITCコンジュゲートSTRO-1抗体で標識し、FACS解析で決定した場合に、STRO-1bright細胞は非明細胞(STRO-1dull/neg)よりも大きな蛍光シグナルを生じる。好ましくは、「bright」細胞は、出発試料中に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約0.1%を構成する。他の実施形態では、「明」細胞は、出発試料中に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約0.1%、少なくとも約0.5%、少なくとも約1%、少なくとも約1.5%、または少なくとも約2%を構成する。好ましくは、「bright」細胞はSTRO-1bright、VCAM-1bright、THY-1bright、STRO-2brightおよび/またはCD146bright細胞である。国際公開公報WO01/04268号に記載のように、STRO-1bright細胞など、標識強度に基づいて選択された細胞の部分集団は、細胞マーカーの陽性/陰性の同定のみで選択された部分集団よりも高い割合のMPCを有する。本発明のさらに好ましい例では、MPCは、STRO-1bri、LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-セレクチン、L-セレクチン、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、β-1インテグリン、6-19、トロンボモジュリン、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、レプチン-R、(STRO-2=レプチン-R)、RANKLおよびCD146またはこれらのマーカーの任意の組合せからなる、間葉系前駆細胞に特異的な表面マーカーの群から選択される少なくとも2つのマーカーを保有する。本発明のさらに好ましい例では、MPCは、CD34、CD14、CD45、CBFA-1、II型コラーゲン、PPARγ2、およびグリコホリンAからなる群から選択される少なくとも1つのマーカーについて陰性である。【0026】MPC濃縮集団の調製方法は、国際公開公報WO01/04268号および国際公開公報WO2004/085630号に記載されている。cells:TSCC)である他の細胞と共に存在する。国際公開公報WO01/04268号は、骨髄からこのような細胞を約0.1%〜90%の純度レベルで収集することについて言及している。代替の収集方法の結果、より低いレベルで存在するMPCの割合がもたらされ得る。vivoで増殖させた集団であり得る。【0029】たとえば、本発明の方法を、それらが存在する集団の全細胞の少なくとも約0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80または95%を含む、収集した、増殖していない、実質的に精製したMPC集団に適用し得る。このレベルは、たとえば、STRO-1bright、VCAM-1bright、THY-1bright、CD146brightおよびSTRO-2brightからなる群から選択される少なくとも1つのマーカーについて陽性である細胞について選択することによって達成し得る。【0031】このような細胞の好ましい供給源はヒトであるが、本発明が、ウシ、ヒツジ、ブタなどの農業動物、イヌおよびネコの家畜、マウス、ラット、ハムスターおよびウサギなどの実験動物、またはウマなどのスポーツに用いられる動物を含めた動物にも適用可能であることが予測される。本明細書中で使用する用語「子孫」とは、MPCに由来する細胞をいうことを意図する。子孫は前駆細胞または完全に分化した細胞(骨細胞など)であり得る。好ましい一実施形態では、子孫は前駆細胞である。cells:TSCC)である。前駆細胞は1つの分化経路に分化能確定しているが、これは一般に、成熟した完全に分化した細胞のマーカーを発現したりそのように機能したりしない。したがって、前駆細胞は、関連する種類の細胞を生じさせるが、その正常な状態では幅広い細胞種を作製しない。前駆細胞は1つの細胞または組織の系統種に分化能確定する傾向にあるが、二分化能性であり得る、すなわち、2つの異なる細胞または組織種へとさらに分化する能力を有しうる。cell);ニューロンへと進行する神経前駆体;心筋および心筋細胞の前駆体、グルコース応答性インスリン分泌膵臓β細胞系が含まれる。グリア、神経、星細胞およびオリゴデンドログリア細胞。線維性の結合組織を含めた結合組織を特異的にもたらす細胞も含まれる。本発明の好ましい例では、前駆細胞は骨前駆細胞である。本明細書中で使用する「骨前駆細胞」とは、骨芽細胞へと分化または増殖する能力を有する任意の細胞である。好ましい骨前駆細胞には骨前駆細胞および前骨芽細胞が含まれる。本発明の方法によって達成される増強された増殖は、未刺激の対照と比較して10、20、30、40または50%を超えるMPC数の増加をもたらし得る。増加は1倍、2倍またはそれ以上であり得る。本発明の好ましい例では、SDF-1類似体はCXCR4シグナル伝達を活性化するリガンドである。Inc、カナダ)からなる群から選択される。(PDGF)、幹細胞因子(SCF)、fit3リガンド(FL)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-6(IL-6)、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(1,25D)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターロイキン-1β(IL-1β)からなる群から選択される刺激因子にも曝す。situであり、外来SDF-1またはその類似体を当該部位に送達する場合にも適用性を有し得る。このような送達は1回で十分であり得るが、時間的に間隔をおいた送達により、より促進したまたはより大きな利点がもたらされ得る。外来SDF-1またはその類似体は、ポリペプチドの形態または発現させてポリペプチドを生じさせることができる核酸の形態で対象に投与し得る。外来SDF-1またはその類似体は、核酸含有組成物の形態またはSDF-1もしくはその類似体を過剰発現するように遺伝子改変した宿主細胞の形態で投与し得る。vivo送達の状況下では、MPCまたはそれに由来する子孫を含む組成物を(SDF-1もしくはその類似体と同時に)送達することも望ましい場合がある。内皮細胞)に分化能確定していることが好ましい。存在することが知られているマーカーについて分別した形態で提供し得る。situで存在するMPCを分化させるために、1つまたは複数の分化刺激因子を含み得る。発生させる方法も提供する。ち細胞および内皮細胞からなる群から選択され得る。vivoの促進のための例示的な条件は、当業者に周知であろう。血管組織の産生または修復に適用し得る。ならびに血管細胞からなる群から選択される細胞もしくは組織の産生または修復に適用し得る。vivoで産生させる方法を提供する。【0047】MPCまたはそれに由来する骨前駆細胞の骨への分化を偏らせる条件は、たとえば、10%のFCS、100μMのL-アスコルビン酸-2-リン酸、デキサメタゾン10-7Mおよび3mMの無機リン酸塩を添加したαMEM中で培養することを含み得る。代替例では、この方法は、骨前駆細胞をI型コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブリン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、オステオカルシン、またはオステオネクチンの存在下で培養することによって、骨前駆細胞を骨芽細胞へと分化させることを含み得る。具体的な一例では、骨前駆細胞をI型コラーゲン、フィブリノーゲン、およびフィブリンの存在下で培養する。代替例では、骨前駆細胞をI型コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブリン、オステオカルシン、およびオステオネクチンの存在下で培養する。この方法の状況下では、I型コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブリン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、オステオカルシン、もしくはオステオネクチンは、単独で、または成長因子の存在下で用い得る。本段落中上記に記載の化合物の任意の組合せが本発明によって企図されることを理解されたい。本発明はまた、単離したMPCもしくはそれに由来する子孫およびSDF-1またはその類似体を含む組成物も提供する。好ましい例では、組成物は、組成物の全細胞の少なくとも約0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80または95%を構成する、実質的に精製したMPCまたは子孫を含む。【0051】さらに好ましい例では、SDF-1もしくはその類似体は、約0.1nM〜0.1M、0.1nM〜0.05M、0.05nM〜15μMまたは0.01nM〜10μMの濃度で組成物中に存在する。本発明はまた、SDF-1を過剰発現するように遺伝子改変したMPCまたはそれに由来する前駆細胞も提供する。一例では、MPCまたはそれに由来する前駆細胞は、SDF-1をコードしているポリヌクレオチドを導入されている。別の例では、MPCまたはそれに由来する前駆細胞のゲノムは、SDF-1タンパク質の過剰発現をもたらすように改変されている。一例では、SDF-1タンパク質の過剰発現がもたらされるようにMPCまたはそれに由来する前駆細胞のSDF-1遺伝子の調節領域を改変する。本発明はまた、本発明の遺伝子導入されたMPC集団を含む組成物も提供する。本発明の組成物は、1つまたは複数の追加の刺激因子をさらに含み得る。追加の刺激因子は、PDGF、SCF、FL、G-CSF、IL-3、IL-6、1,25D、TNF-αおよびIL-1βからなる群から選択され得る。本発明には、選択された組織種、たとえば損傷組織をコロニー形成させるために本発明の組成物(たとえば遺伝子改変したMPCを含む組成物)を全身投与または局所投与する送達系が包含される。本発明の組成物を標的組織内に直接注射し得る。注射部位は、好ましくは傷害部位または損傷組織の周辺である。SDF-1を発現する遺伝子改変したMPCおよび特異的な組換えリガンドまたは受容体を対象に導入し、その後、標的組織中で同族結合パートナーの発現を誘導することによって細胞を所望の標的組織の標的とさせ得る。本発明の組成物が、組織の、たとえば、虚血性もしくは再灌流関連傷害によりアポトーシスが起こる心筋細胞;骨、靱帯、腱もしくは軟骨の外傷傷害後の軟骨細胞;またはアルコール誘発性肝硬変における肝細胞の修復あるいは再生で用いる、移植したMPCまたはそれに由来する細胞の生存を増強させるために有用であることは、理解されよう。具体的な一例では、本発明の組成物は、骨の修復または再生で用いる移植したMPCもしくはそれに由来する細胞の生存を増強させるために有用である。したがって、本発明の組成物は、吸収性ゼラチン、セルロースまたはコラーゲンなどのマトリックスをさらに含み得る。組成物はスポンジ、ストリップ、パウダー、ゲルまたはウェブの形態で用いることができる。本発明はまた、対象中のMPCもしくはそれに由来する子孫を外来SDF-1またはその類似体に曝すことを含む、対象において骨を産生する方法も提供する。本発明はまた、本発明の組成物を対象に、所望の骨産生部位で投与することを含む、対象において骨を産生する方法も提供する。【0061】この方法は、たとえば骨の修復で用いてよく、したがって、本発明の組成物および任意選択で適切な担体を、骨形成を必要としている部位内に導入し得る。したがって、たとえば骨傷害または腫瘍に感染した骨切片の除去によって生じた骨格欠損は、本発明の組成物を欠損部位内に移植することによって修復し得る。reconstruction)または脊椎固定もしくは関節融合などの骨融合等の骨の増強を必要とする他の条件は、増強を必要としている骨の部位内に本発明の組成物を投与することによって個体において治療し得る。組成物は、そこからの骨形成を補強するのに十分な程度に、たとえば、ゼラチン、セルロースもしくはコラーゲン系媒体などの再吸収性バイオポリマーと組み合わせるか、またはリン酸カルシウムセラミックビヒクル中であり得る。再吸収性バイオポリマーはパウダーまたはスポンジの形態であることができ、好ましくはブタ皮膚由来ゼラチンである。セラミックビヒクルは、粒子形態であるか、または構造的に安定した三次元移植片の形態であることができる。構造的に安定した三次元移植片は、たとえば、立方体、シリンダー、ブロックまたは適切な解剖学的形態であることができる。組成物は、新しい組織の形成に近似した速度で分解、再吸収または再構築される1つもしくは複数の他の成分を含んでいることもできる。適切な方法および技術には、Caplan他、米国特許第5,226,914号および米国特許第5,837,539号を参照されたい。【0062】この方法は、人工装具を固定する補助としても用い得る。したがって、股関節、膝および肩の置換で用いられるものなどの人工装具の表面を、移植前に本発明の組成物でコーティングし得る。その後、組成物中のMPCまたはそれに由来する子孫が骨形成細胞に分化して、それにより骨質の内植および人工装具の取込みのプロセスが加速され得る(Caplan他、米国特許第5,226,914号および米国特許第5,837,539号参照)。上記方法は、個体に、MPCもしくはそれに由来する子孫が骨形成系統へと分化することを誘導または加速する少なくとも1つの生物活性因子を投与することをさらに含み得る。生物活性因子は、たとえば、デキサメタゾンなどの合成糖質コルチコイド、またはBMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6もしくはBMP-7などの骨形態形成タンパク質であることができる。関節内注射に適した液状もしくは半固体状の担体中であることができる。本発明はまた、対象中のMPCもしくはそれに由来する子孫を外来SDF-1またはその類似体に曝すことを含む、対象において血管組織を産生する方法も提供する。本発明はまた、本発明の組成物を対象に所望の血管組織の産生部位で投与することを含む、対象において血管組織を産生する方法も提供する。本発明はまた、対象中のMPCもしくはそれに由来する子孫を外来SDF-1またはその類似体に曝すことを含む、対象において心筋または平滑筋を産生する方法も提供する。本発明はまた、本発明の組成物を対象に心筋または平滑筋の産生部位で投与することを含む、対象において心筋または平滑筋を産生する方法も提供する。本明細書全体にわたって、単語「含む(comprise)」、または「含む(comprises)」もしくは「含むこと(comprising)」などの変形とは、記載した要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を包含することを暗示するが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を排除することを暗示するわけではないことを理解されたい。1-αおよび1-βは、そのメンバーが白血球を活性化させ、しばしばリポ多糖、TNFまたはIL-1などの炎症誘発性刺激によって誘発されるインタークリンファミリーに属する小さなサイトカインである。インタークリンは、2つのジスルフィド結合を形成する4つの保存されたシステインの存在によって特徴付けられている。これらは2つのサブファミリーに分類することができる。CCサブファミリーでは、システイン残基は互いに隣接している。CXCサブファミリーでは、これらは介在アミノ酸によって隔てられている。SDF-1タンパク質は後者のグループに属する。上述のように、SDF-1には少なくとも2つの既知のアイソフォームが存在し、これらはSDF-1αおよびSDF-1βとして知られている。1995)は、ヒトSDF-1ゲノムクローンを同定し、αおよびβアイソフォームが単一遺伝子の選択的スプライシングの結果であることを示した。α型はエクソン1〜3に由来し、一方でβ型はエクソン4由来の付加配列を含む。ヒト遺伝子全体は約10kbであり、染色体10q11.1に位置する。別段に記述しない限りは、本明細書中で使用する用語「SDF-1」とは、少なくともαおよび/またはβアイソフォームをいう。好ましい実施形態では、本発明はαアイソフォームの使用に関する。1998);およびGenBank寄託番号AF189724参照)。ヒトαアイソフォームのアミノ酸配列を配列番号1として提供し、ヒトβアイソフォームのアミノ酸配列を配列番号2として提供する。SDF-1タンパク質の好ましい形態は、前述の哺乳動物SDF-1タンパク質のうちの1つ、または他の種から得たその相同分子種と同一のアミノ酸配列を有する精製ネイティブSDF-1タンパク質である。【0073】1つもしくは複数の特定のモチーフおよび/またはドメイン、あるいは任意の大きさ、たとえば、長さが少なくとも5、10、25、50、または75個のアミノ酸に対応するSDF-1生物活性断片は本発明の範囲内にある。断片を産生し(組換えまたは化学合成によって)、ネイティブSDF-1タンパク質の類似体として機能できるペプチジル断片を同定するために試験することができる。【0074】SDF-1変異体は、ネイティブSDF-1タンパク質とは1つまたは複数のアミノ酸が異なるペプチド配列を有する。そのような変異体のペプチド配列は、ネイティブSDF-1タンパク質の1つもしくは複数のアミノ酸の欠失、付加、または置換を特長とすることができる。アミノ酸の挿入は、好ましくは約1〜4個の連続的なアミノ酸の挿入であり、欠失は、好ましくは約1〜10個の連続的なアミノ酸の欠失である。【0075】SDF-1変異体は、当分野で知られている様々な技術により産生することができる。SDF-1変異体は、別々の点突然変異(もしくは複数の点突然変異)を導入することによって、または切断によってなど、突然変異誘発によって産生することができる。変異は、ネイティブSDF-1タンパク質と実質的に同一の機能的活性を有するSDF-1変異体を生じさせることができる。ネイティブSDF-1タンパク質の機能的活性の1つまたは複数を構成的に発現する、タンパク質の作用形態を産生し得る。産生することができる他のSDF-1タンパク質変異体には、たとえばプロテアーゼの標的配列を変更する突然変異によって、タンパク質分解的切断に耐性のあるものが含まれる。ペプチドのアミノ酸配列の変化によりネイティブSDF-1タンパク質の1つまたは複数の機能的活性を有する変異体がもたらされるかどうかは、ネイティブSDF-1タンパク質の機能的活性について変異体の試験を行うことによって、たとえば、本明細書中に記載のように変異体がMPCの増殖を刺激する能力を試験することによって、容易に決定することができる。点突然変異または切断によって作製したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および特定の特性を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングするための広範な技術が、当分野で知られている。そのような技術は、一般に、SDF-1遺伝子変異体のコンビナトリアル突然変異誘発によって作製した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能であろう。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も幅広く使用されている技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター内にクローニングすること、生じたベクターライブラリーを用いて適切な細胞を形質転換させること、および、所望の活性の検出により、その産物が検出された遺伝子をコードしているベクターの、比較的容易な単離が促進される条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることが含まれる。現在、SDF-1は、G結合7回膜貫通CXCR4受容体の唯一の知られている天然に存在するアゴニストである(当分野でフーシンまたはLESTRとしても知られている)。MPCはCXCR4受容体を発現することが示されている(ヒト分子は配列番号3として提供する)。したがって、本明細書中に記載のSDF-1の生物学的効果は、ケモカイン受容体CXCR4によって媒介される可能性が最も高い。したがって、本発明の方法に有用なSDF-1類似体はCRCX4アゴニストでもあり得る。本発明は、MPCが、本明細書中に記載の生物活性がそれによって完全に、またはCRCX4などの別の受容体と一緒になって、CXCR4以外の受容体を発現する可能性を排除しない。本明細書中で使用する用語「SDF-1類似体」とは、SDF-1に構造的または機能的に関連しており、本発明の方法での使用に適した任意の分子をいう。好ましくは、SDF-1類似体はSDF-1のCXCR4結合に対するアンタゴニストである。2005に記載の分子が含まれる。