M29/2002号)。8週間後に移植片を回収し、4%のパラホルムアルデヒド中で2日間固定し、その後、さらに10日間、10%のEDTA中で脱灰したのちに、パラフィンに包埋した。それぞれの移植片を2つの小片に切断し、切断表面を下にしてパラフィン包埋した。組織学的解析には、移植片の5μm切片を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色し、各移植片の中心とどちらかの末端との代表的な長さは約3〜4mmであった。新しい骨形成の量は、12個の組織切片中に存在する全表面積の割合として計算した。統計スチューデントt検定を用いて、示したように対による比較を行った。統計的有意性は0.05未満のPで与えられた。示したように、複数の比較について分散の一方向解析(ANOVA)を用いた。フィッシャーを用いたグループ間の統計的有意性により、0.05未満のPで最小有意差検定が提示された。PCTAU2004/000416号)。vivoで拡大させたMPC子孫を様々な細胞系統に関連したマーカーに基づいて特徴付けるデータを提示する。よって単離した様々な系統に関連する遺伝子の遺伝子発現プロフィールを検査した(図1A)。ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHの発現を参照として、ImageQantソフトウェアを用いて、それぞれの細胞マーカーの相対的な遺伝子発現を評価した(図1B、C)。vivoで拡大させたMPCのタンパク質発現プロフィールを検査した(図2)。STRO-1dimおよびSTRO-1bri培養細胞の遺伝子ならびにタンパク質発現に基づいた一般的な表現型の要約を表3に示す。vivoで拡大させたSTRO-1briMPCが、アンジオポイエチン-1、VCAM-1、SDF-1、IL-1β、TNFα、およびRANKLを含めた血管周囲細胞関連マーカーが示差的により高い発現を示すことを示唆している。vivoで拡大させた細胞は、ネスチン、GFAP、オステリックス、オステオカルシン、SOX9、GATA-4、レプチン、および平滑筋ミオシン重鎖をより高いレベルで発現した。心筋芽細胞を含めた分化能がより確定した前駆細胞種の表現型特徴を示すSTRO-1dim細胞と比較して、より未熟かつ血管周囲様の表現型を示すと考えられる。STRO-1dimとSTRO-1bri培養細胞とのタンパク質および遺伝子発現プロフィールの比較を表3ならびに4に要約する。らは次に、STRO-1dimとSTRO-1bri培養細胞との遺伝子およびタンパク質発現プロフィールで観察された差異が、複数の細胞系統へと分化するその能力における任意の機能的差異を反映しているかどうかを検査した。vivoで拡大させたSTRO-1bri/CD146+に由来する細胞の培養物は、上述のようにそのSTRO-1抗原の発現に基づいたFACSによって単離した。FACSで単離したSTRO-1dimおよびSTRO-1bri培養細胞を、脂肪(図3)、骨(図4)および軟骨(図5)形成の誘導条件下で植え付けた。すべての場合で、STRO-1bri培養細胞は、STRO-1dim培養細胞と比較した場合に、特定した条件下で脂肪、骨および軟骨を形成する能力がより高いことが示された。これらの実験からのデータは、上記より得た遺伝子およびタンパク質の発現結果を実証しており、STRO-1bri培養細胞は、適切な培養条件下で任意の特定した細胞系統に向かって分化するよう影響を与えることができる、分化能確定がより弱い前駆細胞を高い割合で含む原始集団であり(図3、4、5)、MPCと呼び得ることを明示している。逆に、STRO-1dim培養細胞は様々な系統を表す分化能確定細胞を高い割合で含み、TSCCと呼び得る。Stro-1dim集団は異質性であり、様々な組織種の範囲に個別に分化能確定した細胞を含むことが提案される。vivoで拡大させたMPCに由来する細胞集団の同定は、臨床治療のためのStro-lbri細胞に由来する全培養調製物の使用において顕著な意味をもつ。最初の研究は、原始的な、分化能確定がより弱いSTRO-1bri培養MPCがより成熟した、分化能確定したSTRO-1dim培養TSCCの成長に与える影響を検査するように設計した。実験は、単離したSTRO-1bri培養MPCを増加させながら、事前に蛍光タグCFSEで標識したFACSで単離したSTRO-1dim培養TSCCと共に加えるように設計した。図6は、標識されたSTRO-1dim細胞の増殖が未標識STRO-1bri細胞の存在によって成されることを示している。CFSEで標識した細胞が分裂する際、2つの娘細胞は親細胞の蛍光の半分を含む。したがって、娘細胞の様々な世代は比例して減少し続ける蛍光強度を有する蛍光分布として表され、ここで、ヒストグラムの一番右の曲線(垂直線が交わっている)は最初のSTRO-1dim集団の点を表す(図6)。データにより、その増殖速度を増加させるためにより高い割合のSTRO-1dim細胞を刺激することが実証され、5%を超えるSTRO-1bri細胞を加えた後により多くの細胞が少なくとも3〜4回の分裂を行うことが示された。vivo拡大を得るためには、培養物は5%を超えるSTRO-1bri細胞が集団内に存在することを必要ということになる。vivoで影響を与えることができるかどうかを決定するために、さらなる調査を行った。vivoモデルを用いた。第1のモデルでは、左前下行枝(LAD)冠状動脈の結紮を受け、48時間後に生理食塩水、FACSで単離した培養したヒトSTRO-1dimおよびSTRO-1bri細胞ならびにSTRO-1除去骨髄単核細胞の新鮮な吸引液を注射した無胸腺症ヌードラットを用いた(図7)。2週間後、動物を屠殺し、心臓組織を固定して2つのモノクローナル抗体で同時に染色した:1つ目はラットと選択的に反応性を有するがヒトのKi67抗原との反応性は有さず、2つ目は心筋細胞マーカーのトロポニンIと反応性を有する。増殖中のラット心筋細胞の指標である二重に染色された細胞は、免疫ペルオキシダーゼ技術によって検出した。STRO-1briヒト細胞を受ける動物は、生理食塩水またはSTRO-1dimヒト細胞を受ける対照動物と比較して、2.5〜5倍高い数の増殖中のラット心筋細胞を示した(図7)。皮下注射した無胸腺症ヌードラットを利用した。2週間後、ラットに生理食塩水、FACSで単離したヒトSTRO-1dimまたはSTRO-1briヒト細胞のいずれかの腫瘍内注射を与えた(図8)。1週間後、動物を屠殺し、腫瘍組織を固定して2つのモノクローナル抗体で同時に染色した:1つ目は平滑筋細胞によって発現されるα-平滑筋アクチン抗原と反応性を有し、2つ目は血管内皮細胞によって発現されるvWF抗原と反応性を有する。内皮および平滑筋をどちらも含む細動脈ならびに動脈の指標である二重に染色された構造は、免疫ペルオキシダーゼ技術によって検出した。STRO-1briヒト細胞を受ける動物は、生理食塩水またはSTRO-1dimヒト細胞を受ける対照動物と比較して、腫瘍内の細胞注射部位において3.5〜8倍高い数の細動脈および動脈を示した(図8)。ヒト細胞を注射した位置から遠位の部位では差異が見られなかった。vivoで拡大させたSTRO-1briMPCの割合を増加させる効果について検査した(図9)。