BMSSCクローン細胞系は、増殖、RT-PCR、免疫組織化学、および発生学的研究のための血清充満培地中での継代培養ののち、以下に記載のようにSTRO-1bri/VCAM-1+分別細胞に由来する14日目のコロニーからの限界希釈によって作製した。Inc.、カリフォルニア州Auburn)上で分離した。Associates、アラバマ州Birmingham)と共にさらに20分間、氷上でインキュベーションを行った。Dickinson、カリフォルニア州Sunnyvale)を用いて細胞を分別した。STRO-1bri/CD106+またはSTRO-1bri/CD146+細胞を20%のウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン、アスコルビン酸-2-リン酸(100μM)を添加したα-変法イーグル培地中で培養して、5%のCO2中、37°Cの加湿雰囲気中で初代培養を開始させた。手短に述べると、MPCの初代培養またはMPCに由来する細胞をトリプシン/EDTA消化によって遊離させ、その後、30分間、氷上でインキュベーションを行った。約2×105個の細胞を洗浄し、その後、200μlの一次抗体カクテル中に1時間、氷上で再懸濁させた。一次抗体カクテルは、各チューブ中、飽和濃度のマウスIgMモノクローナル抗体STRO-1およびマウスIgGモノクローナル抗体またはウサギIgG(表1)からなっていた。細胞内抗原と反応性を有する抗体を用いた染色には、細胞をまずPBSで洗浄し、その後、氷上で10分間、70%のエタノールで処理することによって透過処理し、その後、染色前に洗浄した。マウスアイソタイプIgMおよびIgG陰性対照Mabを同一条件下で処理した。Associates)のどちらかと、最終体積100μlで曝した。FIX(1%(v/v)、2%(w/v)D-グルコース、0.01%のアジ化ナトリウムを添加したPBS)に固定した。Coulter、フロリダ州Hialeah)で解析した。細胞透過性フルオレセイン系色素CFSEを用いて、MPCに由来する細胞の発達中における分裂関連の表現型および機能の変化を研究した。CFSEは細胞の細胞質成分に共有結合して均一な明るい蛍光をもたらし、これは、細胞分裂時に娘細胞に等しく分配される。この技術により、最大8サイクルまでの細胞分裂のフローサイトメトリーによる分解が可能となる。vivoで拡大させたMPCに由来する細胞の単細胞懸濁液を1回洗浄し、1mlのPBS/0.1%のBSAに再懸濁させ、2μlの5mMのCFSE(最終10μM)を加えたのち、37°Cで10分間、インキュベーションを行った。染色は、5倍体積の氷冷培地α-MEM-10を加えて氷上で5分間インキュベーションを行うことによって停止させた。細胞を培地中で3回洗浄し、その後、1×105の低密度で培養フラスコ(T-25)に植え付けた。様々な時点で、トリプシン-EDTAによって細胞を剥離し、フローサイトメトリー解析によって解析した。初代MPCに由来する培養物をトリプシン/EDTA処理によって遊離させ、その後、上述のようにSTRO-1上清で染色した。Associates、アラバマ州Birmingham)と共に20分間、氷上でインキュベーションを行った。Dickinson、カリフォルニア州Sunnyvale)を用いて細胞を分別した。Inc.、テキサス州Houston)を用いて、製造者の提案に従って溶解した。Biotech、スウェーデンUppsala)を用いて調製したcDNA合成の鋳型として用いた。1999)を用いて、PCR増幅によって評価した。1.5%アガロースゲル電気泳動によって解析し、臭化エチジウム染色によって可視化した。RNAの完全性はGAPDHの発現によって評価した。鉱物の堆積は陽性フォンコッサ染色によって同定した。オイルレッドO染色を用いて脂質を持った脂肪細胞を同定した。