6〜8週間後に植込みを回収し、4%のパラホルムアルデヒドで2日間固定し、その後、さらに10日間、10%のEDTA中で脱灰化したのち、パラフィンに包埋した。(10ng/ml)中で増殖させた。脂肪の発達:単層培養物を、10%のウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン、アスコルビン酸-2-リン酸(100μM)、0.5mMのメチルイソブチルキサンチン、0.5mMのヒドロコルチゾン、60mMのインドメタシンを添加したα-変法イーグル培地(JRH)中で増殖させた。軟骨の発達:ポリプロピレンチューブ中のペレット培養物を、1%のウシ血清アルブミン、トランスフェリン(100μg/ml)、インスリン(2μg/ml)、L-グルタミン(2mM)、アスコルビン酸-2-リン酸(100μM/ml)、デキサメタゾン(10-8M)、およびBMP-7(50ng/ml)、TGFβ3(10ng/ml)を添加したα-変法イーグル培地中で増殖させた。骨格/心筋の発達:単層培養物を、10%のウシ胎児血清、L-グルタミン(2mM)、アスコルビン酸-2-リン酸(100μM/ml)、および5-アザシトシン(5μM/ml)を添加したα-変法イーグル培地中で増殖させた。上皮の発達:単層培養物を、ウシ下垂体抽出物(50μg/ml)、表皮成長因子(10ng/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、インスリン(5μg/ml)を添加したケラチノサイト基底培地(Clontenics)中で増殖させた。象牙芽細胞の発達:単層培養物を、10%のウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン、アスコルビン酸-2-リン酸(100μM)、デキサメタゾン(10-7M)およびBMP-2(50ng/ml)を添加したα-変法イーグル培地中で増殖させた。-BB(10ng/ml)を添加したα-変法イーグル培地中、48-ウェルプレート中で増殖させた。International、カリフォルニア州Temecula)、および抗ヒトアネキシンV抗体(マウスIgG1;Chemicon)を、それぞれ1:2に希釈した組織培養物上清として、または10μg/mLの精製した免疫グロブリンのどちらかとして用いた。Ashman教授、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、ニューキャッスル大学の好意により提供)。Biotec)上で分離した。dull)STRO-1発現に基づいて、MACSで単離したSTRO-1+骨髄単核細胞の分別を行った(図1A)。1999に記載のように、STRO-1および骨関連抗原アルカリホスファターゼ(AP)、B4-78を同定する抗体と共にインキュベーションを行った。約2×107個の細胞を、STRO-1およびアルカリホスファターゼ(B4-78)に反応性を有する抗体と共に、1時間、氷上でインキュベーションを行った。複製チューブを、対応する単色かつ陰性の対照抗体と共にインキュベーションを行った。Associates、アラバマ州Birmingham)と共に、45分間、氷上でインキュベーションを行った。【0196】カルシウムフラックスアッセイトリプシンで剥離した二次BMSSC培養物の単種細胞懸濁液を、1%のウシ胎児血清(FCS)および1.25mMのCaCl2を添加したHBSS中で、1×106個の細胞/mLの濃度まで再懸濁させた。Probes、オレゴン州Eugene)と共に30分間、37°Cでインキュベーションを行った。細胞を2回洗浄することによって過剰のfura-2-AMを除去し、細胞を1%のFCSおよび1.25mMのCaCl2を含む2mLのHBSSに、1×106個の細胞/mLの最終濃度まで再懸濁させた。Elmer、マサチューセッツ州Boston)を用いて、340および380nmの交互する励起ならびに510nmの蛍光発光で、[Ca2+]iを測定した。[Ca2+]iのベースラインレベルを確立したのち、細胞を30ng/mLのSDF-1αで処理した。SDF-1αに応答して安定した[Ca2+]iのピークが達成されたあと、0.1mMのジギトニンを用いてBMSSCの透過処理を行い、エチレングリコール四酢酸(EGTA)を最終濃度5mMまで加えた。