FavoritesSummary脂肪組織(AT)が激しい免疫細胞の活性化および相互作用の部位である。免疫系のほぼ全ての細胞は、ATに存在し、それらの比は肥満によって変更される。免疫細胞集団ATの適切な分離、定量化、および特性はimmunometabolic病気で自分の役割を理解するために重要である。here.Abstract肥満の齧歯類およびヒトの脂肪組織の増加マクロファージ浸潤(AT)の発見は、局所および全身インスリン抵抗性免疫細胞の寄与の関心の増大につながっている。肥満のさまざまな免疫細胞集団の単離と定量AT今immunometabolismの研究室で一般的に利用技術です。細心の注意を得られたデータは、信頼性と解釈可能であるように間質血管細胞の分離やフローサイトメトリー分析の両方に注意しなければならない。このビデオでは、ダイジェストをミンチし、免疫細胞に富む間質血管の一部を分離する方法を示します。その後、我々は、抗体ラベルマクロファージとTリンパ球と方法、フローサイトメトリー実験でそれらに適切にゲートにする方法を示しています。低脂肪で育てリーン及び高脂肪給餌肥満マウスからの代表的フローサイトメトリープロットが設けられている。この分析の重要な要素は、何の抗体を使用することであるマクロファージで自然自家蛍光であるチャンネルだけでなく、適切な補償コントロールの使用で蛍光を発するではない。我々は今、ATが積極的に直接摂食行動と全身のグルコース恒常性に影響を与えるホルモンの数を分泌する動的な内分泌器官を表していることを理解しています。過去十年間の間質血管画分(SVF)と同様に、ATホメオスタシスへの貢献ATに存在する免疫細胞の多数の人口の増加感謝があった。Rodbellによって記述されていた。コラゲナーゼIIは、ほとんどの場合、脂肪細胞のインスリン受容体1のメンテナンスのため、脂肪細胞とSVF分離のために使用される。ATの早い段階で、酵素分画は主に脂肪を研究するために採用されました代謝をcyteと脂肪前駆細胞を分離する。最近になって、フローサイトメーターの普及状況と市販のフルオロフォア標識抗体の増え続けると組み合わせこの技術は、免疫細胞ATの特徴付けを容易にしている。AT炎症における免疫細胞の存在は以前に2に記載されていたが、ワイズバーグらによる精液の論文。2003年に出版さは、炎症性サイトカインを分泌し、AT-特定および全身インスリン抵抗3,4と相関肥満におけるマクロファージ(ATMの)、ATの蓄積を文書化することが最初でした。5造語を務め、樹状細胞6、肥満細胞7、T細胞8を含む様々な免疫細胞集団を、関与研究によってフォローアップされています-10、Bセル11、NKT細胞12、好酸球13、および肥満関連したインスリン抵抗性の発達中の好中球14,15。ATの細胞を単離するATMなどの特性を、フローサイトメトリーを介してT細胞ATするために使用されるコラゲナーゼ消化技術の詳細な説明を提供することである。このプロトコルは、ATマウスに最適化されていますが、視聴者は16で、人間のために、この手法の最適化に関する広範な詳細を提供する優れた記事を読んでから利益を得ることができる。この記事の対象読者は、限られた経験を持つ研究者でマウスを操作すると、フローサイトメトリーを実行を含む。時間とリソースを持つ細胞の収量と生存能力のバランスをとるためのいくつかの実用的な考慮事項は、免疫細胞集団AT特徴付けるためだけでなく、最適なフローサイトメトリーコントロールとして提示される。librarian.Protocol1。前にこの実験プロトコルを開始するには、次の試薬を準備します。mMの硫酸ナトリウムEDTA2。各機関に固有のIACUC承認された手順に従って、マウスを安楽死させる。徹底的に70%エタノールで毛皮が濡れ。剣状突起のレベル(胸骨の下の部分)に切開を行い、心臓を露出する胸腔を開いて、すべての主要な血管を切断しないように注意しながら。注:この時点で、それはできるだけ絞りをそのままにしておくことも有用である可能と血液を可能にし、胸腔から流出する潅流液に胸郭の右側のノッチをカットする。血を許可し、循環系をエスケープする潅流液に右心房をクリップ。注意:AT肥満マウス、過剰心を扱うときは、心臓へのアクセスを許可するために除去する必要があるかもしれません。鉗子で心をつかみ、静かに頂点を通して左心室に針を挿入します。15ミリリットル滅菌PBSでマウスを灌流。注意:肺は記入して拡大し始めたら灌流率を減らします。腹膜腔を開き、任意の性腺組織を避けるように注意して使用してperigonadal脂肪パッドを取り外します。DPBSをマグネシウム(Mg又はCaなし)を含む氷の上にボートを比較検討し、細かい部分にATをミンチ。gを超える場合、2つの計量船との間に均等に分割する。DPBSから成るサンプルAT当たり3ミリリットルコラゲナーゼ消化液を調製。mlコニカルチューブに移します。rpm)で°Cでホモジネートでインキュベートする。コニカルチューブや氷​​の上の場所に10ミリリットルのDPBSを(0.5%BSA)を追加します。mlコニカルチューブに100μmのフィルターを介して細胞懸濁液を渡す。4&Dで10分間500×gで細胞懸濁液を遠心例えば、C.混入赤血球を溶解する3ミリリットルACKバッファー内の上清をデカントし、再懸SVF細胞ペレット。追加°Cで上清をデカントし、FACSバッファーで再懸SVF細胞ペレット。mlコニカルチューブの底をカバーする場合、0.5〜1ミリリットルFACS緩衝液を使用するインチ再懸濁するためにどのくらいのFACS緩衝のためのガイドとして細胞ペレットのサイズを使用し、それ以外の場合、0.25から0.5に再懸濁ミリリットル。場所氷上でサンプルと混合40μlのFACS緩衝液、50μlのトリパンブルー溶液(0.2%)、および10μlの細胞懸濁液で細胞計数のために、各サンプルの10倍希釈のアリコートを準備します。mlの最終濃度に細胞懸濁液を希釈。細胞表面抗原の染色0.5-1μg/106細胞の最終濃度に抗マウスCD16/CD32抗体(FCブロック)を追加し、10分間、氷上でインキュベートする。ATMやT細胞を分析する場合、別々のチューブを用意し、必要な補償と修正蛍光マイナス1(FMO)コントロールに対応するために、チューブの適切な数を準備するために余分なセルを結合します。注:例として、F4/80とCD11bをに基づいてATMの割合を定量するとき、次の補償およびFMOコントロールが準備する必要があります。​​またはアイソタイプコントロールを追加します。30分間4°Cで光とインキュベートからサンプルを保護します。追加°Cで2ミリリットルFACS緩衝液で上清をデカントし、再懸SVF細胞ペレット。4°C分、再懸濁しSVF細胞ペレット用に細胞懸濁液を500×gで遠心します。35μmのセルストレーナーチューブトップを装備し12×75ミリメートルポリスチレン丸底チューブにサンプルを転送します。4で光、店舗サンプルから守る°CをFACS分析まで。注:最適な結果を得るために細胞をimmeadiately分析する必要があるが、このプロトコルとFACS解析に成功し、4°Cで1-2時間、FACSバッファーに格納された標識された細胞上で実施されている細胞は蓄積時間を増加させるために修正する必要がある場合は、標識した細胞をFACS分析の前に24時間、4°Cで2%パラホルムアルデヒド°Cで固定することができる。抗体会社は、標識した細胞を1週間に戻る保存することができることを示唆しているが、これは、この手順のコンテキスト内でテストされていません。FACS分析FACS分析に先立ち、生/死細胞の区別を可能にするために、サンプルと適切なコントロールに生存染料を追加します。注:多数の生存色素は市販されているが、DAPIやPIは励起/発光教授に応じて推奨されている使用されるフ​​ルオロフォア標識抗体の諸島。mlの最終濃度を各サンプルに添加する。注:SVF細胞ATの分析のために、SSCはリニアスケールでFSC対ログスケールで表示されることをお勧めします。非常に大きく、粒状であるATMのを分析する際にSSCのログ·スケールを使用することは特に重要です。2を中心とする)は、単一のパラメータヒストグラムの左端になるように光電子増倍管(PMT)のゲインを調整する適切なチャネルのために。</李>注:これは、リンパ球やマクロファージ(または他の骨髄細胞)により、自家蛍光の違いに別々に分析することをお勧めします。マルチカラー補正を実行するために、単一の染色されたコントロールや抗体捕捉補償ビーズを使用してください。注:補償ビーズの使用が推奨されますが、各抗体の互換性が確保されなければならない。補償ビーズが単離された細胞は、適切な単一シミ制御を得るために必要とされる場合には、ウサギ抗体と交差反応しないかもしれない。修正されたFMOコントロールに基づく実験的ゲートを設定します。関心のある集団の有病率に基づいてイベントの適切​​な数を収集し、実験データを記録するためにフローサイトメトリーを設定する。オフライン分析用にエクスポートFCSデータファイル。フローcytometrための利用できる多数のプログラムがありますyのデータ解析。我々はCytobank、investigatoresを格納し、分析データを、インターネット回線18を持つ任意のコンピューターからの数字を生成することができ、Webベースのプラットフォームをお勧めします。Cytobankがアクセス可能なデータを公開するか、協力者へのアクセスを制限する機能を提供しています。Results差動遠心分離し、ATのコラゲナーゼ消化は、低脂肪(脂肪から10%キロカロリー)または高脂肪(脂肪から60%キロカロリー)食(LFDとHFDを与えた雄のC57BL/6Jマウスの精巣上体脂肪パッドからSVFを分離するために使用されました、それぞれ)16週間。図2)AT割合を定量化するためにフルオロフォア標識1次抗体で標識した。図1Aおよび2Aに示されている。図2Aの最初の散乱光ゲートが自家蛍光骨髄細胞を含むことを避けるためにリンパ球集団に限定されていることを強調すべきである。実験のゲートを設定するように変更さFMOコントロールの使用例を、図1Bに示されている。)抗体が自家蛍光と非特異的結合を考慮して適切なアイソタイプコントロールに置き換えられます。+)を識別するために描かれています。ATためのゲーティングが図2Bに示されている。)のための最初のゲートで制御されています。)のためにゲートされています。脂肪組織マクロファージ。SVFを雄C57BL/6JマウスのAT精巣から分離されたは、コラゲナーゼダイジェストプロトコルを使用して16週間の低脂肪または高脂肪食を与えた。Subsequently、SVF細胞は、F4/80とのCD11bについて染色し、FACS分析のATMを識別するために、フローサイトメーターを用いて行った。(A)初期光散乱と生存ゲート。(B)が変更されたFMOは象限ゲートを整列するために使用されたF4/80とCD11bを組み込むためアイソタイプ抗体を制御します。大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。