SVFは、雄C57BL/6Jマウスの精巣上体脂肪組織から単離されたのTを用いて16週間低脂肪または高脂肪食を与え彼コラゲナーゼダイジェストプロトコル。続いて、SVF細胞は、T細胞AT特徴付けるために、フローサイトメーターを用いて行ったTCRβ、CD4及びCD8a及びFACS分析のために染色した。(A)初期光散乱と生存ゲート。T細胞(右欄)の割合(BC)の比較。ここをクリック大きい数字を表示する。librarian.Discussion肥満の代謝結果における免疫系の役割への関心の高まりは、ATの免疫細胞を特徴付けるためにフローサイトメトリーの普及につながっている。正確なプロトコルは、独自の経験や利用可能な装置に基づいて研究室の間で異なりますが、重要なステップは、コラゲナーゼ消化、差遠心分離し、細胞表面抗原のラベルが含まれています。ATの単離のための詳細なプロトコルと実用的なガイドを提供することである。任意の実験技術と同様に、または大幅に望ましい結果に影響を与えるかもしれません、多数のバリエーションがあります。我々の経験に基づいて、本明細書の詳細なプロトコルは、時間、リソース、細胞の収率、及び細胞生存率との間の最も効率的なトレードオフを表す。私たちはその増加を発見したコラゲナーゼ同様の濃度でコラゲナーゼII消化の期間に限り60分、セルラー収率にほとんど影響を与え、したがって、我々は、コラゲナーゼ露光の長さを減少させるために20分間消化を利用する。コラゲナーゼIIは、脂肪組織消化のために最も一般的に使用されるコラゲナーゼである。異なるコラゲナーゼとその主な用途のすべての記述は、Sigmaのウェブサイトで見つけることができます。gの(脂肪から60%キロカロリー)である16週間であった。コラゲナーゼダイジェスト時間を変えることに加えて、食事療法を含め、使用されている実験モデルに応じて、現在のプロトコルへの潜在的な変更がいくつかあります。コレステロールや飽和脂肪酸のために豊かに食を与えたマウスから、AT収穫時に、前のミンチために氷の上にサンプルを維持するのを避けるTは固化し、ミンチが困難になります。第二に、我々のプロトコルでは、赤血球溶解ステップ(3.6)が含まれますが、成功した最初の灌流は、多くの場合、この手順は不要になります。2を加えないように注意しなければならない。大きいカルシウム濃度は、リン酸カルシウム沈殿物の形成をもたらすことができる。この沈殿物は、最初の遠心分離工程(3.5)次のフォーム場合は、沈殿物を除去するために赤血球溶解ステップの前に20ミリリットルFACSバッファー(EDTAを含む)を持つ2つの洗浄ステップを追加します。第四に、我々はSVFを分離する際に研究者が少なくとも一つの全体perigonadal脂肪パッドを使用することをお勧めします。我々はしないため、細胞収量の制限は、この勧告を行うことなく、様々な細胞集団は、19種類の地域の分布を表示しているため。ATに存在する免疫細胞を分離する。全体の脂肪パッドは1.2グラムよりも大きい場合は、吻側から尾側端部に長手方向に脂肪組織を分割する。半分このように分かれている場合は、それぞれの半分は、細胞の代表的な人口を提供する必要があり、一般的に1.2グラム未満でなければなりません。これはまだ以上の1.2グラムであることを、我々は別々のチューブに1.2グラムのセグメントのコラゲナーゼ消化を行うことをお勧めしてから、フローサイトメトリーのためのSVFのすべてのセルを結合する。リーンマウスについては、フローサイトメトリー分析のために十分なSVF細胞を得るために2つまたは3つのマウスからの脂肪パッドを結合する必要があるかもしれない。追加のマウスの必要性は、実験を設計する際に考慮されるべきである。最後に、データを表示するための別の方法は、組織のグラム当たりのセルの数である。セル密度が望まれる場合、ATはミンチし、消化の前に計量されるべきである。フローサイトメトリー二介してSVF細胞AT特徴付けるに関しての点が強調されるべきである。すべての蛍光色素標識1次抗体は、SVF細胞をATで使用するために検証する必要があり、適切に滴定。ATでこれらの抗体を滴定していた。PE-Cy7が)タンデム色素の使用はお勧め。このようなPE及びFITC等の蛍光色素は、上述のように慎重に滴定した後に使用されるべきである。我々は一般的に推奨される濃度と共にSVF細胞AT特徴付けるために使用される特定の抗体のリストを表1に記載されています。高濃度で使用した場合のATMの展示強い自家蛍光および抗体の数は、非特異的結合の低レベルを表示するため、第二に、我々は修正されたFMOの使用は実験的なゲートを設定するために制御をお勧めします。FMOコントロールは20実験サンプルにラベルを付けるために使用される抗体のすべてが、1つでコントロールサンプルのセットを染色することによって生成されます。私たちは、適切な蛍光体共役アイソタイプコントロールではなく、単にそれを削除すると抗体の1つを置き換えるために我々のプロトコルでFMOコントロールを変更しました。実際には、正と負の集団間の例外的な分離を提供抗体FMO制御を差し控えることが許容されるかもしれない。これらのコントロールに加えて、前方と側方散乱に基づいてリンパ球やマクロファージ集団のために我々は事前選択、抗体上のゲートの前のことを注意します。このようなFITCおよびタンデム色素として蛍光団とのリンパ球集団を分析するとき、これは自家蛍光マクロファージの検出を除去することができます。詳細なプロトコルは、この記事の範囲を超えていますが、説明分離技術は、特性を目的とした多数の技術のための重要な第一歩としてATに存在する免疫細胞をterizing。上記の単離および染色プロトコルは、mRNAは、遺伝子発現を分析するために単離することが可能な特定の集団の選別を容易にするために使用することができる。vivoでの治療を可能にすることができる。そのような修正は、その後2回洗浄し、適切な細胞培養培地に再懸濁されるSVFを得るために利用する滅菌技術を含むであろう。細胞表面抗原を染色する蛍光色素標識抗体を添加することなく、SVFは、線維芽細胞と脂肪細胞にも付着することができるように、これは純粋な集団であると主張することはできないが(プラスチック付着を介してATMを濃縮するために未処理の組織培養プレートに添加することができる)。これは、培養することにより37°Cで2-4時間、SVFを達成している°C非接着細胞を除去するには、2つの洗浄工程が続く。ATMのは、それに応じて処理され、EDTAベースの細胞解離そうを使って収穫することができるフローサイトメトリーのための分解能またはそれぞれ、RNAまたはタンパク質の単離のためにトリゾールまたはRIPA緩衝液中に溶解した。Rodbellによって記述脂肪細胞とSVF細胞を単離するためのコラゲナーゼダイジェスト手法は免疫細胞と肥満の代謝影響への貢献、ATの特性のための非常に貴重なツールであり続けている。librarian.Disclosures我々は、開示することは何もありません。よってサポートされています(12EIA8270000)。フローサイトメトリー実験は、リソース共有VMCフローサイトメトリーで行った。VMCフローサイトメトリーの共有リソースがバンダービルト消化器病研究センター(DK058404)によってサポートされています。gdpr@jove.com.。