qPCRにより総粒子、HCAdVの感染単位と最終ベクター準備中のHV汚染レベルを測定します。滴定手順のスキームは、図6に示されています細胞が翌日に90%コンフルエントに達するように、6または12ウェル組織培養プレートでHEK293細胞を播種します。感染性ウイルス粒子の数(感染力価)を決定するために、1μlのステップ5.9から精製されたウイルスを10μlと第2のウェル)をマルチウェルプレートに1ウェルの細胞に感染する3。細胞を回収し、3時間の感染後。ピペットを用いて、トリプシンで細胞をオフフラッシュし、室温で3分間890×gで細胞をスピンダウン。DPBS200μl中ペレット化した細胞を再懸濁し、自由(非感染性)ベクター粒子を除去するために、それらを徹底的に洗ってください。室温で890×gで3分間遠心します。上清を捨て、新鮮なDPBS200μlの細胞ペレットを再懸濁します。:感染力価の正確な決意するためには、治療と十分な洗浄をトリプシンにより細胞表面からすべての非感染性ウイルス粒子を除去することが重要です。ピペットを用いて、それらの培養培地で細胞をオフに洗浄することにより、トリプシンなし総ウイルス粒子数(感染性粒子と非感染性粒子=物理的な力価)、2つのウェルから収穫非感染HEK293細胞を決定すること。室温で890×gで3分間細胞をスピンダウン。培地を捨て、DPBS200μlのペレット化した細胞を再懸濁します。蘇bsequentlyそれぞれ、細胞に直接1μlの精製HCAdV準備の10μlを添加します。gDNAの単離およびその後のQ-PCRのための同じ条件を確実にするために、背景として非感染細胞を使用してください。)ステップ7.3由来HEK293細胞)からのgDNAを単離し、7.53秒間DPBS(ステップ7.3および7.4)200μlに再懸濁した渦細胞は、SDS溶液200μlを添加します。mlで)、および3秒間渦サスペンション。55°Cで12〜16時間インキュベートし、ゆっくりと振ります。ml)を加え、37°Cで30分間インキュベートします。15,000×gで2分間のイソアミルアルコールおよび遠心分離機:クロロホルム:フェノールの350μLを加えます。M)および氷1mlの冷EtOH(99.8%)を追加し、懸濁液を混ぜます。Centri15,000×gで10分間FUGEサンプルはゲノムDNAをペレット化します。gで、上清を除去し、70%エタノール500μlのを追加し、2分間遠心します。上清を除去し、70%エタノールの500μlを添加し、室温で30分間振とうします。その後、15,000×gで2分間遠心します。上清と空気乾​​燥DNAペレットを削除します。それは、溶液中のgDNAを得るために困難であるように、長い時間のために乾燥していないDNAペレットを実行してください。Oを120μlのDNAペレットを再懸濁し、振とうしながら37°Cで約1時間インキュベートします。DNA溶液が粘稠表示された場合、37°Cで数時間のためにそれを振る、または約1時間55°Cでインキュベートします。1の標準曲線を生成します。nMのを使用して定量PCRを適用します。20秒、10秒、72°Cでプレインキュベーションを95°Cで10分間、10秒間95°Cの40サイクルで増幅を、55°C以下のようにPCRプログラムを設定します。標準曲線(ステップ7.7)に基づいて、反応中のアデノウイルスゲノムの合計数を補間します。次formularを使用して、最終ベクター調製物中のアデノウイルスゲノムの数を計算します。/重量の数)×(μlの感染ディッシュ/体積のウイルスのすべての細胞のDNAのNGで重量)。8ウイルス粒子/μlの周りにあります。ここに示されたよりも10倍高いまたは低い力価は、正常とみなすことができます。高い力価を改善することになります。図7A)感染性であることを示しています。HVと汚染レベルを決定するために、HVのゲノムに存在するアデノウイルス後期遺伝子3(L3)の一部を増幅することによって定量PCRを行います。標準曲線(ステップ7.7)を生成するために、アデノウイルス後期遺伝子3(L3)を有するプラスミドを使用してください。10分間95°Cでプレインキュベーション/活性化を、1分15秒、60°C、95°Cの40サイクルの間増幅を次のようにPCRプログラムを設定します。定量PCR反応のために任意のユニバーサルプローブのPCRマスターミックスを使用してください。図7A)を参照してください。最後に、ベクター調製物の品質を評価するためにHV汚染レベルにHCAdVの絶対的な感染性粒子の割合を算出します。注:これまで、残りのHVの小さな部分を除外することはできません。可能な限り少ないHVなどのベクター調製物は、動物実験のために使用されようとしている場合は特に、望ましいです。ResultsここでHCAdV製剤のクローニング、増幅および精製のための代表的な例が示されています。図2)が設けられています。図2A)に示されている(参照も1.2〜1.5ステップ)。kbのバンドを観察することができます。GOI発現カセットを含むバンドは、次いで、アガロースゲルから精製されます。連結後(ステップ1.8を参照)、フェノール-クロロホルム抽出、エタノール沈殿およびSWAが続く私はライゲーション産物は、細菌やクローンに変換され、ノーカットpAdFTCとその後のフェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿(ステップ1.9)を除去するためにダイジェストをアンピシリン上で選択されていますLB-寒天プレートを含みます。通常、クローン数百数十が得られ​​、5〜10個のクローンは、プラスミドDNAのミニ調製物のために調製されます。図2C)が示されています。ここで陽性クローンは、5キロバイトバンドを示さないことは、空pAdFTCと負のクローン中に存在し、1.7kbの断片が表示されます。それは空pAdFTCと負のクローンには存在しません。このそれぞれのGOIは、これはthaのクローニングが成功したことを示します。IST二回116細胞へのトランスフェクションに続くDNAの高純度を確保するために、フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を用いて精製しました。図2D)に対応します。図3)に示されています。ベクタープリ増幅プロセスの監視の代表的な例は、(設けられています。図4A)が示されています。ベクターゲノムの数は、通常、最初の通路の間にdescreasesと強く以降の通路に増加することに注意してください。7は、3リットルのスピナーフラスコ中で大規模生産のための116細胞を感染するのに十分です。HCAdVベクターゲノム内GOIはGFP発現カセットを含んでいる場合、プリ増幅プロセス(セクション2)は、蛍光顕微鏡によってモニターすることができます。図4B)が示されています。GFP陽性細胞の数は、通常、最初の通路の間に減少し、強く後半の通路に増加することに注意してください。3リットルのスピナーフラスコ中で大規模生産のために116細胞に感染します。GFP発現カセットを含むHCAdVの大規模増幅プロセスは、組織培養皿にスピナーフラスコから移した培養培地および細胞の顕微鏡分析によりモニターしました。図4C)が設けられています。細胞が先行する細胞増殖が十分であったことを示す塊に成長しているし、細胞が健康であることに注意してください。これらの細胞の蛍光顕微鏡〜100%を使用するときには、バイオリアクターで効率的なベクター生産の懸濁細胞の効率的な形質導入を示し、GFP陽性でした。ベクター粒子は、塩化セシウム超遠心分離によって培地と3リットルの懸濁培養細胞から精製しました。図5)が示されています。後n個のCsCl段階勾配を使用して初期の遠心分離は、通常、2つのバンドが観察されます。図5A)を含むDNAで構成されているのに対し、上のバンドは、部分的なキャプシドの空が含まれています。ベクター粒子を含むDNAは、続いて(ステップ5.6)を回収し、ベクター粒子を濃縮するための第二の超遠心分離工程のためにプールします。図5B)のために採取されたベクター粒子を含むDNAの単一バンドになります。HV汚染の数を測定することによって特徴づけられました。図6)が設けられています。図7)が示されています。棒グラフは、典型的なベクター粒子の数を示していますこのプロトコルに記載された手順により得られました。図7A)により測定しました。経験は、ODの力価は、ウイルス粒子の数を過大評価することを、示しています。ODにより測定された絶対ウイルス粒子は、Q-PCRにより測定された感染性ウイルス粒子よりも500倍高い20-することができます。両方のQ-PCR(セクション7)により測定したときに感染性ベクター粒子をusally絶対粒子の5〜10%の範囲です。ベクター調製物は、非常に良好な品質を有している場合、絶対粒子の20%以上が感染性です。図7B)の1〜5%の範囲です。HVは、複製欠損であるので、これは許容可能です。それにもかかわらず、できるだけ少ないHV汚染など(感染性粒子の<1%)になります好まれます。pAdFTCにGOIをクローニングする図1のフローチャート。GOIはpHM5シャトルプラスミドのMCSにクローン化します。​​、フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製されています。消化pAdFTCプラスミドを脱リン酸化されるのに対し、消化pHM5は、(も1.5ステップ参照)、目的の遺伝子を精製する調製用アガロースゲルにロードされています。クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製されます。フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿に続くライゲーション産物のその後のSWA私ダイジェストを挿入せずにpAdFTCを有するクローンの成長を防ぐことができます。