here.AbstractIntroduction遺伝子治療用途のためには、ウイルスタンパク質の発現、トランス遺伝子単独で、または着信ウイルスタンパク質により引き起こされる細胞傷害性および免疫原性の副作用を回避するために非常に重要です。アデノウイルスベクター(ADVが)が広く導入遺伝子発現1,2の影響を調査するために多種多様な細胞に外来DNAを導入するために使用されます。AdVの最も先進的なバージョンは、3,4、すべてのウイルスコード配列を欠くし、それによって、低免疫原性および低毒性5-8と合わせ35キロバイトまでのパッケージング能力を提供する高容量アデノウイルスベクター(HCAdV)で表されます。その高い包装能力に彼らは、単一のベクター用量を使用して、大規模または複数の導入遺伝子の送達を可能に。したがって、彼らは、研究コミュニティのための貴重なツールを表します。HCAdVのゲノム構造とウイルス生産はより複雑です。9-12に基づいています。IとI-CEU私によって解除することができ、プラスミドpAdFTCに含まHCAdVのゲノム中に存在する同じ制限部位に後続導か挿入するためのダイジェスト。(ITR)としてゲノムパッケージングに必要な非コードアデノウイルス配列が隣接しています終了し5'ITRの下流のパッケージングシグナルの両方で。追加のスタッファーDNAは、ウイルス産生の間に効率的なパッケージングを確保するために、27〜36キロバイトの範囲の最終HCAdVゲノムの最適なサイズを提供します。剪断力を避ける慎重な取り扱いが推奨されます。I制限酵素認識部位に隣接されます。わけではありません、私はHCAdVのプロデューサー細胞株へのウイルスゲノムのその後のトランスフェクションのためにダイジェストによって解除することができます。制限酵素の使用はありません私のrelのためのプラスミドpAdFTCからウイルスゲノムの容易さは、挿入された導入遺伝子ではなく、私のDNA認識部位を欠いていることを意味します。HEK293細胞ベースのプロデューサー細胞(116細胞)を安定的にCreリコンビナーゼを発現します。複製およびパッケージングに必要なすべてのADV遺伝子を提供するヘルパーウイルス(HV)と同時感染しています。4内で発現Creリコンビナーゼによるウイルス増幅中に除去されるflox化パッキング信号と第一世代のAdVです。これは、完全なパッケージングシグナルを含む主にHCAdVゲノムがキャプシド化されることが保証されます。HCAdVの前増幅は、組織培養皿内の表面上に成長させた116細胞における連続継代工程を行うことによって行われます。それぞれの継代後、ウイル​​ス粒子は、3つの連続した​​凍結融解工程を行うことにより、感染細胞から放出されます。細胞の数を増加させるあらゆる通路はに感染していると前の通路からの細胞溶解物の1/3。最後に、前増幅ステップが、大規模な増幅のためのスピナーフラスコ中の懸濁液中で増殖させたプロデューサー細胞を感染させるために使用されてから最終的に溶解物。4,12を行うことにより、懸濁細胞から精製されます。この手順で空の粒子と完全に組み立てられた粒子は、2つの別個の帯域に分割されています。HCAdVを濃縮し、第2の非段階的な超遠心分離工程が実施される粒子。その後HCAdVを含む得られたバンドを回収し、生理的な緩衝液に対して透析します。最終ベクター調製物は、絶対的なウイルス粒子の感染性粒子およびHVの汚染レベルの数に関して特徴付けられます。絶対的なウイルス粒子は、ウイルス粒子を溶解し、260nmの吸光度を測定することにより、または定量的リアルタイムPCR(定量PCR)12を実行することによって決定することができます。PURの感染ifiedウイルス粒子は、感染した細胞3時間後、感染中に存在HCAdVゲノムを測定するqPCRにより決定することができます。注:全てのプラスミドは、11,12、以前に説明され、リクエストに応じてご利用いただけますされています。1に概略的に示されています。pHM5-GOIを生成するために、選択肢のクローニング戦略を使用して、シャトルプラスミドpHM5にプロモーターおよびポリアデニル化シグナル(PA)を含む、目的の遺伝子(GOI)を複製します。注:pAdFTCが比較的大きいプラスミドであるので、古典的なプラスミド調製プロトコルはシリカ膜に基づいている商業用プラスミド精製キットを用いて、プラスミドDNAのSheeringのを避けることをお勧めします。​​たDNAの電気泳動移動度を変更します。クロロホルム抽出およびエタノール沈殿(ステップ1.3)をアガロースゲル電気泳動の前に必要とされます。ORF配列と〜31キロバイトなど)を線形化する全量100μlインチエタノール(エタノール)の沈殿13に続くフェノール-クロロホルム抽出を使用して、線状化プラスミドを精製します。クロロホルム:フェノール100μlの追加イソアミルアルコールを、チューブを数回転倒混和します。15,000×gで2分間遠心。M)と氷冷EtOH(99.8%)の400μlを添加し、激しくサスペンションを混ぜます。15,000×gで10分間遠心。gで上清を除去し、70%エタノールの300μlを添加し、2分間遠心します。その後、上澄み液と空気乾燥DNAペレットを削除します。Oの10〜20μlのペレットを溶解それは、溶液中のDNAを取得するには困難であるように、あまりにも長い間乾燥していないDNAペレットを実行してください。個別のpHM5プラスミドバックボーン(2.8キロバイト)とGOI(ステップ1.4)から調製アガロースゲル上および商業ゲル状とPCR-クリーンアップキットを用いてGOIをゲル精製し。消化物の代表的なアガロースゲルを図2Aに示されています。I-消化pAdFTC(ステップ1.4から)、37°Cで1時間25μlの総容量で、フェノール-クロロホルム抽出とその後のエタノールにより脱リン酸化プラスミドpAdFTCを浄化PRecipitation(ステップ1.3)。O20μlのDNAを溶出ダイジェストが完了していると予想される断片の大きさは、線形化pAdFTCの正しい(〜31キロバイトであるかどうかを分析するために(ステップ1.6から)脱リン酸化pAdFTCプラスミドのアリコートと(ステップ1.5)から精製されたGOI-フラグメントから分析ゲル電気泳動を行います)。:GOIのサイズは、導入遺伝子発現カセットのサイズに応じて可変です。その後のライゲーションのために、それぞれの断片の相対濃度を推定します。図2Bに示されています。DNAリガーゼと1の挿入するためのベクターのモル比を用いて20μlの総容量でライゲーション反応を設定します3。Oを添加しなければならないように、できるだけ多くのDNAを使用します。クロロホルム抽出を行います。U)で精製し、ライゲーション反応を消化。クロロホルム抽出を行うことによって、DNAを精製します。mlのアンピシリン)。5〜10個のクローンを選択し、フェノール-クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿(ステップ1.3)13に続いてアルカリ溶解を用いてプラスミドDNAのミニ調製物を準備します。DNA断片のサイズを確認するためにアガロースゲル電気泳動に続いてプラスミドミニ調製物の分析ダイジェストを行います。図2C)を解放するためのものです。mlのアンピシリン)及び市販のプラスミド精製キットを使用して、MIDIまたはマキシプラスミド調製を行います。ありません使用して、全量100μlと二回エタノール沈殿に続くフェノール-クロロホルム抽出を行います。Oに溶解させ、ゲル電気泳動により1:10に希釈消化pAdFTC-GOI-DNAのアリコートを確認してください。kb断片と、GOIのサイズに応じて、HCAdVゲノム(サイズ:28〜36キロバイト)のための第二のDNA断片が検出可能です。注:ない私ダイジェストの代表例を図2Dで表示されます。線状化DNAを数週間4°Cまたは-20°Cで数日間保存することができます。プロトコルに進む前に、ヘルパーウイルスAdNG163R-2は4増幅されたことを確認してください。ml)を添加したMEMイーグル培地中で培養116細胞。)を60mm組織培養皿でトランスフェクションの1日前に、彼らは次の日に50〜80%の密集度に達することになります。図3A)のような方法を使用して116細胞へのステップ(2.1)から、線形化HCAdVゲノムをトランスフェクトします。静かに、感染後の最初の時間の間、皿ごとに20分を動かします同じHV分布を確保。CPEが観察された48時間は、以前のHVの量は持っています削減すること。CPEが後に起動した場合、より多くのヘルパーウイルスを使用しなければなりません。培養培地を用いて培養皿から細胞をオフにフラッシュすることによって48時間の感染後の上清を含む収穫細胞。それらの培養培地中に懸濁された細胞を継代0(P0)と呼ばれます。2つの画分に分割P0。mlの2,000×gで3分間細胞をスピンダウンし、細胞ペレットから培地を除去し、それは後に、増幅プロセスの定量PCRベースの分析のためのゲノムDNA(gDNAの)を単離するために使用されます。処理するまで-20°Cで保存した細胞ペレットを。2.5から剥離した細胞mlのは、その中の3〜4倍に再懸濁された細胞を(°Cまたは液体窒素中で-80で)凍結し(室温でまたは37°Cの水浴中で)解凍することによってウイルス粒子を放出します。この画分は、P0の溶解物と呼ばれるよりもあります。ml)およびHVを補ったMEM培地を用いて、90〜95%の集密度まで増殖させ、116細胞とその組織培養ディッシュを確認し、次の継代の手順で使用できます。