繰り返しステップ2.6)1。再懸濁細胞からP3リリースウイルス粒子の残りの19.5ミリリットルから3〜4回凍結および解凍することによって。この画分P3の溶解物と呼ばれるよりもあります。注:彼らは十分に増幅されるまで、いくつかのベクターは、最終的に150ミリメートル皿に追加の通路が必要な場合があります。したがって、プリ増幅プロセスの有効性は、シリアルパス中に監視する必要がありますエージング。図4Aを参照)に記載されているように、増幅プロセスの定量PCRベースの分析を行うことができます。flourecscent信号を観察することによって評価することができます。定量的リアルタイムPCR(定量PCR)を使用して、増幅プロセスのモニタリング3(また、図4Aを参照)。preamplifaction(2.6ステップ)の各路から細胞ペレットからのgDNAを分離します。最適なPCRの結果については、できるだけ新鮮としてのgDNAを使用しています。なければのgDNAは、さらに使用するまで-20°Cで保存することができます。HCAdVゲノムに含まれるGOIを有するプラスミドのコピー9。2.10)からのgDNAの同じ量を分析します。それぞれの定量PCR化学物質の定量PCRフォローメーカーの指示を行います。55〜60°、10秒間95°Cの40サイクルで増幅を、以下のように定量PCRプログラムを設定します。標準曲線に基づいて、反応におけるHCAdVゲノムの数を補間することができます。ml)を補充した予め温め(37°C)新鮮なMEMの900ミリリットルを追加します。ml)を補充した新鮮な予め加温した(37°C)MEMの10mlで細胞をオフ洗い流します。均質な細胞懸濁液を得るためにアップピペット上下に数回。)ステップ4.1から900ミリリットルを含むスピナーフラスコに細胞を直接転送します。EDTAを使用しないでください。培地を除去した後、すぐにスピナーフラスコに細胞を移します。一度に二つ以上の組織培養皿を処理しないでください。長い待ち時間がより困難に新鮮な培地を追加した後に、組織培養皿から細胞をデタッチすることになります。2組織培養インキュベーター中でマグネチックスターラー上で最適な細胞成長インキュベートスピナーフラスコを確保します。rpmのに磁気撹拌機を調整します。スピナー培養フラスコ中で増殖した細胞が生存しているかどうか、それらが十分な量に成長するかどうかを調べるために、スピナー培養フラスコにおける細胞成長をモニターします。前の60mm組織培養皿にバイオリアクターから新鮮な培地転送を2ミリリットルを追加するたびに。顕微鏡で細胞形態を観察します。図4Cを参照)を示しています。24時間後、それらを組織培養皿の表面にコロニーを形成します。30〜50%コンフルエンスには最適密度を示しています。ml)を補充した新鮮な培地の500ミリリットル(MEM、10%FBS)を加えます。24時間後、この手順を繰り返します。ml)を、新鮮なMEM培地(10%FBS)の千ミリリットルを追加します。AVに達した後、24時間室温で500×gで10分間の遠心分離により3リットル、収穫116懸濁細胞のolume。組織培養フードの下に空にスピナー培養フラスコを保管してください。均質な細胞懸濁液を得るためにピペッティングすることによって約8〜10回上下5%FBSを補充した新鮮なMEM中に再懸濁細胞ペレット。媒体の体積は、ステップ2.10)2からの溶解物かどうかに依存します。mlを、ステップ4.8を参照)。ステップ5.9からオプションa)またはHCAdVの精製されたウイルスストック)2。(ウイルス力価にdepanding幾つかμlを、ステップ4.8参照)2、オプションB)細胞の感染のために使用されます。150ミリリットルの全容量を使用してください。TUからの溶解物内でのウイルス。