2磁気37°Cの組織培養インキュベーター中でスターラー及び5%で9月4.8.1細胞からウイルス混合物を攪拌)または4.8.2)です。ストレージボトルは空気の循環を可能にするために、完全に閉じていないことを確認してください。gで10分間の遠心分離によって細胞を回収。培地を除去し、DPBSの28ミリリットルの全容量でペレット化した細胞を再懸濁。均質な細胞懸濁液を得るために、上下にピペット。懸濁液が完全に凍結されていることを確認し、液体窒素中または-80°Cで細胞ウイルス懸濁液をフリーズします。ウイルス精製を開始するまで-80°Cで細胞ウイルス懸濁液を保管してください。塩化セシウム(CsClの)グラデーションのウイルス溶解物を準備し、37°Cの4倍の水浴中で液体窒素と雪解けのステップ4.11から細胞ウイルス懸濁液)を凍結します。Rで8分間500×gでウイルス溶解物を遠心TとはHCAdVを含む上清を収集します。Oを25ミリリットルで最大。解決までStirrは解決策を明確にし、滅菌フィルターになります。最後に、各溶液1mlを削除して、密度が正しい天気を確認するために細かい規模でそれを量ります。1ミリリットルを、それぞれ1.5グラム、1.35および1.25グラムを重み付けする必要があります。Oを添加した後、再びdensitiyを測定します。密度が正しくなるまでの手順を繰り返します。密度が低すぎると塩化セシウムの粉末を少量添加することにより、それを調整します。滅菌フィルター再度、濃度をチェックしてください。密度は依然として低すぎる追加MORのCsCl、滅菌フィルターをもう一度、濃度を確認した場合。密度が正しくなるまでの手順を繰り返します。6明確な超遠心管に塩化セシウムステップ勾配を準備します。図2C)の3ミリリットルを。3の塩化セシウム層の上にステップ5.2からオーバーレイクリアベクター上清の〜4.5ミリリットル)。rpm)で少なくとも2時間、12°Cで、スイングアウトローター(SW-41)を使用して、超遠心分離でグラデーションデブリ。注:最適な条件の下では、細胞破片FORMESの拡散バンドの上にチューブ。2白のバンドの下に観察することができます。5A)に等しいのに対し、上方のバンドは、空の粒子が含まれています。3の塩化セシウム溶液にまで追加し、慎重に混合します。)遅い加速と減速しています。顕著な低域に存在HCAdVを収集します。緩衝液交換のために収集したウイルス粒子を透析。mlのピ​​ペットを用いてチューブ内に)ステップ5.8から収集したウイルスを転送します。チューブ内の気泡を避け、プラスチック製のクランプ透析閉鎖と反対側にそれを閉じます。2)1リットルに透析します。mMのスクロース、pHは7.8)を使用します。ステップ5.9)2から透析ウイルス粒子を収集します。mlのpを使用してipette。希望小容量(25〜100μl)を、複数のアリコートを調製し、-80°Cで精製したウイルスを保管します。6.光学密度(OD)によって最終HCAdV製剤の物理的な力価を測定します溶解緩衝液475μL(10mMのトリス-HCl(pH7.5)、10mMのEDTA(pH8.0)でステップ5.9)2から最終のベクター調製物の25μlを、0.5%SDS))を希釈し、穏やかに20分間振とうRTと最終的には15,000×gで、室温で2分間遠心します。260ナノメートル(A260)での吸光度の値は通常低いため、100μlの上清を用いて吸光度を4回測定し、4つの測定値の平均値を算出します。