この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図pAdVFTCからHCAdVゲノムのクローニング手順とリリースの2代表的な結果。IとI-CEU私ダイジェスト(も1.2〜1.5ステップ参照)によってpHM5からGOI-発現カセットの(A)リリース。​​、GOI-発現カセットおよび精製、脱リン酸化pAdVFTCを精製した。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。AdNG163R-2とbsequent感染[4]。L貯蔵緩衝液に対して透析します。MOI、感染多重度はこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。(また、セクション3を参照)。GOIは、導入遺伝子としてGFPが含まれている場合は、予備増幅工程は、蛍光顕微鏡によってモニターすることができる。スピナーフラスコにおける大規模な増幅プロセスの(C)代表的な結果は、GFPをコードするために例示HCAdV。左側のパネルには、スピナーフラスコから感染した116細胞の顕微鏡写真を示します。培地および細胞のサンプルを60mm組織培養皿に移しました。増幅された細胞の塊が見えることに注意してください。右側のパネルには、蛍光顕微鏡を用いて同じ画像を表示します。細胞のほぼ100%がGFPを運ぶHCAdVで形質導入されています。こちらをクリックしてください。この図の拡大版を表示します。CsCl勾配遠心分離後図5.代表的な結果ステップ勾配を実行した後、(A)(も5.5ステップ参照)。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。F絶対粒子:Unifected細胞をトリプシン処理し、遠心分離によって収集されたマルチウェルを形成します。​​濁精製ウイルスが追加され、ゲノムDNAを単離した後。ゲノムDNAの(C)の単離。(D)定量的PCR(Q-PCR)を行うウイルスゲノムコピー数を定量化するために。これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。最終ベクター調製物の特性7.代表的な結果を図。(A)異なる方法で決定提示プロトコルに従ってベクター調製物の粒子の絶対数:OD価は定量PCR(セクション7)により測定された光学密度(セクション6)、感染力価とHVの汚染によって測定された(B)qPCRs(セクション7)により測定した全感染HCAdV粒子とHVの汚染レベルとの比率。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。librarian.Discussionここで紹介するプロトコルは、以前に記載された手順4,12に基づいて、ヒトアデノウイルス5型に基づくHCAdVベクターの精製を可能にします。pAdFTCプラスミド内HCAdVゲノムは、すべてのアデノウイルス遺伝子を欠いているだけ5'-および3'-のITRおよびパッケージングシグナルを運びます。効率的なウイルス産生に必要なすべての遺伝子を提供します。これは明らかに第一および第二世代のADVSまたは広く使用されているレンチウイルス(LV)をoutcompetes最大35キロバイトの包装容量を提供しています。vivoでのアプリケーションのためのHCAdVの第2の利点は、第一世代や第二世代のADVSとは対照的に、彼らは、細胞毒性のレベルが低下し、ウイルスタンパク質5-8の発現によって引き起こされる免疫原性の副作用が表示されているという事実です。それにもかかわらず、ここで説明されたプロトコルは、より多くの時間であり、このようなLV-またはAAV-ベクトルと同様に第一世代や第二世代ADVSなど他のウイルスベクターよりも集中して作業。主な障害は、大規模な導入遺伝子のクローニングおよびウイルス産生プラスミドPADV-FTCの後に転送することです。クロロホルムのクリーンアップ手順が必要です。そのため、厳密に提供クローニングプロトコルを、次のことは、固くお勧めします。​​、その後プロデューサー細胞株にトランスフェクトしました。最初のトランスフェクション効率が十分なウイルスの増幅を達成するために重要であることに注意してください。重要なことは、プロトコルは、いくつかのステップを提供していますここからの手順は、後続のステップが失敗した場合に再起動することができます。前増幅中に溶解物の三分の一は、再び、その時点からの手順を開始するために、以上のウイルスが産生される必要がある場合には反復を短縮するために、バックアップとして保存することができます。大規模で複雑なまたはいくつかの導入遺伝子を運ぶHCAdVまたは特定のスタッファーDNAが予想よりも遅く増幅することができます。したがって、浮遊培養は、スピナーフラスコ内で成長させる前に、慎重に前増幅プロセスに従うことが重要です。前増幅が成功しない場合、手順は停止し、再び最初から開始されるべきです。前増幅は非効率的である場合、ウイルスの量は3Lのスピナーフラスコ中で増殖させた細胞に感染するのに十分に高くなるまで、追加の継代を必要とすることができます。150から30ミリメートルの組織培養皿を最終継代のために使用することができます。これはより多くの時間であると集中して作業することができます。定量PCR測定のためのgDNAは、ここに記載のいずれかのプロトコルまたは培養細胞からのgDNAの単離のための任意の市販のキットを介して精製することができます。市販のキットを使用して、プロトコルは、一日に短縮することができるが、感染した細胞中に存在するHCAdVゲノムコピーの様々な部分が使用されるキットに応じて、精製の間に失われることがあります。したがってHCAdVゲノムは、ステップ7.4で提示された方法)と比較した場合、Q-PCR測定を以下にやや過小評価されます。11の感染性粒子に1スピナーフラスコの範囲から派生します。実験で多数を実行するのに十分です。インビボ実験でも、標的細胞に依存して、いくつかを行うことができます。9感染性粒子が必要とされています。要約すると、広い細胞親和性と一緒にすべてのウイルス遺伝子を欠いHCAdVベクトルの改善された安全性プロファイルを有するキャプシド改変アデノウイルスを生成する可能性は、これらのHCAdVベクター系を遺伝子治療への応用のための非常に貴重なツールをレンダリングします。librarian.Disclosures著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。gdpr@jove.com.。