簡単に言えば、拡散法は、96ウェルプレートに炭酸カルシウム結晶を形成し、炭酸カルシウム結晶の形態および構造に対する生体高分子の影響を試験するために使用される。これらの実験では、炭酸アンモニウムがアンモニアとCO2に分解され、炭酸カルシウム溶液に拡散し、炭酸カルシウム結晶が形成される(図1および図2)。生体高分子の効果は、添加剤の有無にかかわらず形成された炭酸カルシウム結晶の比較によって評価される。添加剤を添加する前に、最適化された炭酸カルシウム濃度が選択され、溶液およびガラス製品の清潔度がテストされます。2Aは、明確なロンボヘドラル炭酸カルシウム結晶が形成される対照実験の代表的な画像を示す。これらの結晶は、最も可能性の高い石灰質です(図5を参照)。溶液またはプラスチックまたはガラス製品が適切に洗浄されていない場合は、菱形カルサイト結晶に加えて、球状結晶(図2B、赤い円でマーク)が形成されます。球状の結晶は、最も可能性の高いバテライトです(図5参照)。適切な条件の使用のための追加の指標は、対照実験における石灰質面の滑らかさである。3Bはステップで構成される面を持つカルサイト結晶を示しています。ここでの球状の結晶はバテライトです。制御結晶は、結晶形態に対する添加剤の効果が明確に明らかになるように、分離して滑らかなファセットをする必要があります。炭酸カルシウムの形態に対する生体高分子の効果を実証するために、ここではタンパク質TapAを使用しています。図4は、溶液中にTapAの存在下で形成された炭酸カルシウムの結晶を示す。結晶は、制御結晶とは異なります。それらは、複数のカルサイト微結晶で構成される複雑な球状炭酸カルシウムアセンブリを形成する(図5のラマンスペクトルを参照)。結晶の構造を特徴付ける方法の1つがラマン分光法である。図5は、成功(A)および失敗した(B)対照実験から採取したカルサイト(図5A)およびバテライト(図5B)の典型的なスペクトルを示す。cm-1(CO3の対称ストレッチ)2-)。cm-1でのラマンシフトの分割に注意してください。アラゴニテの全スペクトルについては、リファレンス22を参照してください。TapAの存在下で形成された結晶のラマンスペクトルは、カルサイトのスペクトルに類似している(図5A)。単一の炭酸カルシウム多形体の単一スペクトルまたはそれらの組み合わせに対応しない追加のピークが現れる場合、それらはステップ1.1.2.8で完全に洗浄されていない塩化カルシウムの過剰に起因する可能性があります。プロトコルの最後のセクションでは、内部または炭酸カルシウム結晶上の有機物の割合(重量/重量)を測定しました。結晶を酢酸に溶解し、生体高分子を溶液中に放出した。生体高分子が特徴的な吸光度スペクトルを有する場合には、溶液中の濃度を決定することができる。芳香族側基を含むタンパク質の場合、TapAの場合と同様に、280nmでの吸光度が用いられる。酸中の結晶の溶解後に測定されたTapAの吸光度スペクトルは、対照のスペクトル(添加剤を含まない酸溶解炭酸カルシウム結晶;黒色)と共に図6(緑色)に示されている。cm-1の絶滅係数を使用して、TapAの質量パーセントが1.8%±0.2%であったことがわかりました。生体高分子が低pHで凝集しない場合、酸中の結晶溶解後の溶液の吸光度を測定することが可能です。添加剤を含む溶液の吸光度のヌル信号は、その凝集を示す。この場合、熱重力解析(TGA)などの異なる解析方法を使用して、結晶内部/結晶上に存在する添加剤の質量を推定できます。1:炭酸カルシウム結晶の形成のための高速蒸気拡散法の概略記述。カルシウム含有可溶性塩(例えば、塩化カルシウム)は、炭酸アンモニウム粉末の近くに置かれる。ここでは、96ウェルプレートに2つの井戸を示しています。その後、プレートを密封し、アンモニウムをアンモニアと炭酸二酸化炭素に分解してカルシウム含有ウェルに拡散し、炭酸カルシウム結晶の沈殿を引き起こします(カルサイト結晶のSEM画像で示す)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。2:炭酸カルシウム結晶の光学顕微鏡画像。クリーンコントロールは、主に石灰質を含み、これは、ロンボヘドラル結晶(A)によって特徴付けられています。対照サンプルに球状の結晶(赤い円でマークされた結晶など)(B)が含まれている場合は、セクション1.1.1に示すように洗浄プロトコルを繰り返します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。3:2つの制御実験で形成された炭酸カルシウム結晶の電子顕微鏡写真を走査する。菱形結晶(カルサイト)を含むサンプルの画像。壊れた石灰質のファセットと、おそらくバテライトである球状結晶を持つサンプルの顕微鏡写真。この場合、制御実験を繰り返す必要があります。al.16から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。4:タンパク質TapAの存在下で形成されたカルサイト結晶のSEM画像。al.16から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。8.0;黒)のUV/vis吸光度スペクトル。吸光度は、酸中の溶解に続いて、炭酸カルシウム結晶中のTapAの濃度を計算するために使用されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。librarian.Discussionここで説明する方法は、有機添加物の存在下で炭酸カルシウム結晶を形成し、インビトロで炭酸カルシウム結晶の形態および構造に対する有機生体高分子の影響を評価することを目的としている。この方法は、有機添加物の存在下で形成された結晶と対照実験で形成された石灰質結晶との比較に基づいている。決定する方法を示しました。結晶の(重量/重量のパーセンテージ)。我々は、細菌細胞外タンパク質TapAが炭酸カルシウムの形態および構造に及ぼす影響を評価するために使用したプロトコルを説明したが、そのプロトコルは生物学的に精製または合成される他のポリマーに費やすことができる。単一の生体高分子の効果に加えて、この方法は、炭酸カルシウム沈殿に対するそれらの効果における異なるポリマー間の任意の相互性を評価するために生体高分子の混合物と使用することができる。実験セットアップは96ウェルプレートに制限されています。炭酸カルシウム溶液が置かれ、炭酸アンモニウム源から物理的に分離される他のセットアップ(すなわち、溶液および粉末が密閉容器に入れられる)は可能である。mMの典型的な濃度範囲は96ウェル版10、16、23との実験の組み立てのために使用される。密閉ビーカーまたはデシケータも使用できます。低濃度および低容積と互換性がある。マルチウェルプレートで作業することで、1つのマルチウェルプレート実験で同時に複数のパラメータをスクリーニングできます。この方法は、炭酸アンモニウム粉末の位置に対する炭酸カルシウムウェルの相対的な位置に敏感であってもよい。したがって、マルチウェルプレート内の同じ位置に常にウェルを使用し、また、ウェルの位置を変更しても結果に影響を与えないことを確認するために注意する必要があります。通常、実験が行われる井戸と炭酸アンモニウム粉末との間に十分な距離を使用すると、結果が再現可能であることを保証します。セクション1.1.2で説明するように、制御実験で別々の結晶が形成するようにCaCl2溶液の濃度を調整することが重要です。添加剤の濃度は、効果が認められない最小濃度を超えるよう最適化する必要があります。この方法は、添加剤の濃度に対して非常に敏感である点に注意してください。異なる添加濃度は、炭酸カルシウム結晶24の形態および構造に異なる効果を誘発しうる。この方法の主な制限の1つは、アンモニアとCO2の両方が塩化カルシウム試験溶液に拡散するため、実験全体を通じてpHの制御が不十分であることです。CaCO3(s)+H2O(l))および炭酸カルシウムの形成を支持する。導入で説明する追加の方法と比較して、この方法は技術的に簡単です。降水プロセスが遅いため、透明なマルチウェル技術の吸光度または散乱技術を使用して、結晶成長をリアルタイムで追従することができます。結晶成長の動態を追従させるために、我々の研究で行われたように、20時間後ではなく、異なる時点で結晶形態と構造を調べることもできます。この方法は、マグネシウム、バリウム、カドミウム炭酸塩などの小さな十分なKspを有する炭酸塩の他の塩の沈殿を研究するために拡張することができます。librarian.Disclosures著者は何も開示していない。Acknowledgments著者らは、リア・アダディ教授、ジョナサン・エレス教授、ヤエル・ポリティ博士に実りある議論をしてくださったことに感謝したいと思います。この研究は、イスラエル科学財団(ISF)、助成金1150/14によって支援されています。gdpr@jove.com.。