II遺伝子を迅速にタイピングする方法及び該方法に用いるためのプライマーに関する。(以下、本明細書において「MHC」と略す場合がある)分子は、細胞内で蛋白質抗原が分解されてできた抗原ペプチドと結合し、これをT細胞に提示する膜蛋白質であり、その構造と機能の違いから、クラスIとクラスIIに大別される。MHCの最大の特徴は、他には類をみない高度な多型性を持つ点であり、個々の多型はMHC分子の細胞外ドメインの先端に存在する抗原ペプチドを収容する溝に集中している。この多型性は、MHCと結合する抗原ペプチドを規定することになり、免疫応答と疾患感受性の個体差をもたらすことになる。多くがマップされ、MHCの多型と相関して発症する例も存在することから、MHCは病因遺伝子のマーカーとしても注目されている。.【0003】以上の理由により、ヒトMHC(HLA)遺伝子群は、ヒトゲノムの中で最も解析の進んだ領域の一つであり、YACとコスミドベクターを用いたクローニングにより、近年その遺伝子構成の大要が明らかにされた。中心に100にも及ぶ種々の疾患の発症との関与が報告されている。leprosy,マラリア、成人T細胞白血病などにおいて、HLA対立遺伝子またはハプロタイプが有意に増加あるいは減少していることが明らかにされている。ランゲルハンス細胞などの限られた細胞に発現している。-膜結合領域−細胞内領域からなり、免疫グロブリン様構造をなす。飲作用によって取り込まれた細菌や血中可溶性抗原などの外来抗原に由来するペプチドは、クラスII分子の細胞外ドメインの先端部分に存在するペプチド収容溝に結合して、CD4陽性T細胞に提示される。CD4陽性T細胞のうち、ヘルパーT細胞は、B細胞による液性免疫を誘導する。炎症性T細胞は、活性化されるとマクロファージを刺激して小胞内の物質を速やかに破壊するように働く。centromericI、クラスIII、クラスIの各遺伝子領域からなると推定される。BoLAクラスII遺伝子がヒトやマウスのそれと大きく異なる点は、少なくとも15cMの領域をはさんでクラスIIaとクラスIIbの2つの亜領域に分断されていることである。クラスIIb亜領域にはDRとDQの各遺伝子亜領域がマップされている。DYBが同定されている。このようにBoLAクラスII遺伝子の第2の特徴は、ヒトのDP遺伝子亜領域に相当する遺伝子が見つかっておらず、その代わりにヒト遺伝子との対応不明で反芻獣に特異的なDY遺伝子亜領域が存在することである。DRAによってコードされるα鎖とDRB3によってコードされるβ鎖からなるヘテロダイマーがDR分子として細胞表面へ発現し、強い抗原提示能を誘導する。DRB3がBoLA遺伝子の中で最も機能的で多型性に富んでおり、96対立遺伝子が確認されている。DQ遺伝子領域には現在までにDQAとDQB遺伝子が各4個ずつ同定されている。DQB遺伝子は、ハプロタイプによって数や構成が異なっており、一つあるいは二つのDQ分子を形成し、弱いながらも抗原提示能を誘導すると考えられる。BoLA-DRB3のタイピング法として、PCR-RFLP法、マイクロサテライトタイピング法、抗体による識別法などが検討されてきているが、いずれも対立遺伝子を正確に決定する方法として利用することはできない。本発明の課題は、正確かつ迅速にウシのBoLA-DRB3エクソン2(BoLA-DRB3.2)の塩基配列を決定し、遺伝子多型を識別する方法を提供することにある。BoLA-DRB3.2種類のアミノ酸配列における第一超可変部位のアミノ酸配列を基にして遺伝子を群分けし、この群に特異的なプライマーを設計してPCR(ポリメラーゼ・チェーン・リアクション)法によりBoLA-DRB3.2を増幅し、その産物の塩基配列を決定すると、正確かつ迅速にBoLA-DRB3.2の多型を識別できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。theプライマー;を含むプライマーセットを提供するものである。DRB3.2A配列の一部からなる。好ましくは、BoLA-DRB3.2の対立遺伝子の2以上の群の中に、BoLA-DRB3.2の96種類の対立遺伝子が分類されて含まれている。Forwardプライマーである。好ましくは、Forwardプライマーが配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8からなる群から選ばれる塩基配列を有するプライマーである。9の塩基配列を有するプライマーである。sequence.【0011】別の観点からは、BoLA-DRB3.2をコードするDNAの多型を識別するためのPCR用Forwardプライマーであって、BoLA-DRB3.2の対立遺伝子の2以上の群(各群は少なくとも1以上の対立遺伝子を含む)のいずれか1つの群に含まれる対立遺伝子の全てを増幅することができ、その他の群に含まれる対立遺伝子を増幅することができないプライマーが提供される。好ましくは、プライマーはBoLA-DRB3.2の第一超可変部位のアミノ酸配列をコードするDNA配列の一部を有する。BoLA-DRB3.2の96種類の対立遺伝子が分類されて含まれている。8群に分類され、当該8群のいずれか1つの群に含まれる対立遺伝子の全てを増幅することができ、その他の群に含まれる対立遺伝子を増幅することができないプライマーが提供される。好ましくは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8からなる群から選ばれる塩基配列を有するプライマーが提供される。9orwardプライマーであって、配列番号12の塩基配列を有するプライマーも本発明により提供される。stepつのPCR産物が増幅された場合には、BoLA-DRB3.2の全ての対立遺伝子を増幅することができるプライマーセットを用いて増幅した増幅産物の配列を決定し、既知の対立遺伝子の配列と比較する工程;を含む方法が提供される。この方法の好ましい態様では、工程(1)に先立って、ウシゲノムDNAを鋳型としてBoLA-DRB3.2の全ての対立遺伝子を増幅することができるプライマーセットを用いてPCRを行い、得られた増幅産物を鋳型として用いて工程(1)を行うことができる。')プライマーとしてBoLA-DRB3.2の対立遺伝子の2以上の群(各群は少なくとも1以上の対立遺伝子を含む)のいずれか1つの群に含まれる対立遺伝子の全てを増幅することができ、その他の群に含まれる対立遺伝子を増幅することができないプライマー(本明細書において「群に特異的な5'プライマー」と呼ぶ場合がある)を用い、ウシゲノムDNAを鋳型としてPCRによりBoLA-DRB3.2の増幅を行う工程を含むことを特徴としている。このようにして、特定の群に包含される遺伝子を特異的に増幅した後、工程(2)の操作を行うことにより、極めて正確かつ簡便に多型を特定することができる。polymorphism.【0015】ウシ個体からゲノムDNAを調製するための試料としては、末梢血や臓器などを利用することができる。臓器としては、例えば、リンパ節などの組織片を用いることができる。上記の試料からゲノムDNAを調製する方法としては、当業者に利用可能なものであればいなかるものを利用してもよい。1978)を用いることができる。pp.403-413,1978)により調製することができる。cellsの簡便抽出法を用いてもよい。used.【0016】BoLA-DRB3.2はBoLA遺伝子の中で最も機能的で多型性に富んでおり、現在、少なくとも96種の対立遺伝子が確認されており、さらに多くの対立遺伝子が発見される可能性がある。本発明の方法において、群の数は特に限定されないが、上記96種類については好ましくは8群である。')プライマーのいずれかを用いてPCRを行うと、8つの群の1つに含まれる対立遺伝子のすべてを増幅することができ、かつ他の群に含まれる対立遺伝子は増幅されない。BoLA-DRB3.2の第一超可変部位のアミノ酸配列を基にして設計することが可能である。1-8)【0018】また、工程(1)では、Reverse(3')プライマーとして全ての対立遺伝子を増幅することができるプライマーを用いる。このようなプライマーとして、例えば、下記のプライマーを用いることができる。group(5')プライマーとを組み合わせることによって、増幅された遺伝子がどの群に属する遺伝子であるかが容易に特定できる。DNAをテンプレートにして全ての対立遺伝子を増幅可能なプライマーセットを用いて第一のPCRを行うことが望ましい。プライマーセットとしては、例えば、下記のプライマーセットを用いることができる。この工程を採用することによって、解析の精度を高めることができる。group(3')プライマーを用いて増幅産物を得た後、以下の手順で解析を行うことができる。(A)群に特異的なPCR産物が2つ増幅された個体:各々の増幅産物は群に特異的な対立遺伝子を増幅しており、ダイレクトシークエンス法により容易に塩基配列を決定できる。method.【0021】(B)群に特異的なPCR産物が1つのみ得られた個体:全ての対立遺伝子を増幅することができるプライマーセットを用いて増幅した増幅産物の塩基配列を決定し、異なる2種類の対立遺伝子が増幅された場合には、候補が絞られるため既知の対立遺伝子の塩基配列と比較することにより、容易に矛盾のない塩基配列を判定することができる。確認のために、群に特異的な5'プライマーを用いて増幅された増幅産物の塩基配列を決定することができる。全ての対立遺伝子を増幅することができるプライマーセットの種類は特に限定されないが、例えば、下記のプライマーセットを用いることができる。193-195番目の塩基配列の3bpが欠損している対立遺伝子を含む個体の場合には、この欠損対立遺伝子が欠損の無い対立遺伝子の195番目以降の配列をじゃまして識別できなくなることがある。direct-sequence,センス側からの195番目までの塩基配列をあわせることで、両対立遺伝子を決定することができる。実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。20〜40μgを溶解した。C.;及び72°Cで40秒の処理を1サイクルとして20サイクルの処理の後、さらに72°Cで2分間伸長させた。domain法により特異的に増幅できるプライマーを用いた。(PCR-SSP)法で増幅させた。64°Cで30秒;及び72°Cで30秒の処理を1サイクルとして20サイクルの処理を行い、さらに72°Cで5分間伸長させた。第二エクソンがコードするアミノ酸の配列により、対立遺伝子を8群に分け、各々を特異的に増幅できる以下のプライマーを設計した。Reverseプライマー:全ての対立遺伝子を増幅できプライマーとして以下のプライマーを設計した。72°Cで5分間伸長させた。gel,エチジウムブロマイドで染色を施した。検出された増幅産物のバンドが1つであるか又は2つであるかによって、以下のように塩基配列を決定した。シーケンスプライマーとして以下のプライマーを用いた。Ltd.)を用いたシーケンス反応に用いた。Biosystems)でシーケンスを行った。それぞれの対立遺伝子の塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、対立遺伝子を決定した。BDを用いたシーケンス反応に用いた。2種類の対立遺伝子が混ざった状態の配列より、データーベースを用いて各々の配列を決定した。エクソン2の対立遺伝子には194-196番目の塩基が欠損しているものが存在する。欠損のある対立遺伝子と欠損のない対立遺伝子が同時にシークエンスされた場合、Forwardプライマーを用いたシーケンスでは194番目以降、またReverseプライマーを用いたシークエンスでは196番目以前の塩基配列を決定することが困難となる。この場合には、Forwardプライマーによるシーケンスにより解読できる部分とReverseプライマーによるシーケンスにより解読できる部分を総合して2種類の対立遺伝子が混ざった状態の塩基配列を決定し、データベースを用いて各々の配列を決定した。determined.【0032】結果を図1に示す。PCR-RFLPタイプと完全に一致した。(BoLA-DRB3.2),遺伝子多型を識別する方法を提供することが可能になった。図1は、PCR-RFLPによるタイピングが行われたDNAサンプル53種類の塩基配列と本発明の方法で決定した塩基配列との比較結果を示す表である。BoLA-DRB3.2以上の群(各群は少なくとも1以上の対立遺伝子を含む)のいずれか1つの群に含まれる対立遺伝子の全てを増幅することができ、その他の群に含まれる対立遺伝子を増幅することができないForwardプライマー;を含むプライマーセット。Forwardプライマーが、BoLA-DRB3.2の第一超可変部位のアミノ酸配列をコードするDNA配列の一部からなる、請求項1に記載のプライマーセット。BoLA-DRB3.2の対立遺伝子の2以上の群の中に、BoLA-DRB3.2の96種類の対立遺伝子が分類されて含まれている、請求項1または2に記載のプライマーセット。1から3の何れか1項に記載のプライマーセット。Forwardプライマーが配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8からなる群から選ばれる塩基配列を有するプライマーである請求項1から4の何れか1項に記載のプライマーセット。Reverseプライマーが配列番号9の塩基配列を有するプライマーである請求項1から5の何れか1項に記載のプライマーセット。1以上の対立遺伝子を含む)のいずれか1つの群に含まれる対立遺伝子の全てを増幅することができ、その他の群に含まれる対立遺伝子を増幅することができないプライマー。7に記載のプライマー。BoLA-DRB3.2の対立遺伝子の2以上の群の中に、BoLA-DRB3.2の96種類の対立遺伝子が分類されて含まれている、請求項7または8に記載のプライマー。BoLA-DRB3.2の96種類の対立遺伝子が8群に分類され、当該8群のいずれか1つの群に含まれる対立遺伝子の全てを増幅することができ、その他の群に含まれる対立遺伝子を増幅することができない、請求項7から9の何れか1項に記載のプライマー。7及び配列番号8からなる群から選ばれる塩基配列を有する請求項7から10の何れか1項に記載のプライマー。プライマーが配列番号9の塩基配列を有するプライマーであるプライマーセット。BoLA-DRB3.2の対立遺伝子のすべてを増幅するためのForwardプライマーであって、配列番号12の塩基配列を有するプライマー。stepつのPCR産物が増幅された場合には、BoLA-DRB3.2の全ての対立遺伝子を増幅することができるプライマーセットを用いて増幅した増幅産物の配列を決定し、既知の対立遺伝子の配列と比較する工程;を含む方法。工程(1)に先立って、ウシゲノムDNAを鋳型としてBoLA-DRB3.2の全ての対立遺伝子を増幅することができるプライマーセットを用いてPCRを行い、得られた増幅産物を鋳型として用いて工程(1)を行う請求項14に記載の方法。