WO2010/098419を参照)上記[1]-[28]において、Oct3/4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6等を用いることもできる。Sox2(又はSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18)に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7等を用いることもできる。Lin28に代えて他のLinファミリーのメンバー、例えばLin28b等を用いることもできる。【0024】また、上記[1]-[28]には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。核初期化の対象となる体細胞が上記[1]-[28]のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。Lin28及びSV40LTから選択される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。numbersを参照することにより取得することができ(Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。numbersを参照することにより取得できる。)、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。numbersを参照することにより取得できる。【0030】また、上記の各アミノ酸配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有し、且つKlf4の代替因子として野生型タンパク質と同等の核初期化能力を有する天然もしくは人工の変異タンパク質及びそれをコードする核酸も、本発明のKlf4を代替する核初期化物質として利用することができる。してタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピゾーマルベクター等に挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。核初期化物質の体細胞への導入は、特許文献1(WO2015/64705)等、本発明の属する技術分野において用いられている方法を適宜使用することができる。【0033】また、iPS細胞は、分化抵抗性の指標としてC4ORF51、HHLA1、ABHD12B、ZNF541等の因子を用い、これらの因子が有意に発現しない株を選抜したものであってもよい(WO2013/014929参照)。必要な液性因子を供給し、かつ細胞接着の足場となるフィーダー細胞と共に培養しておき、胚様体形成誘導の前に適宜、フィーダー細胞を適宜除去したものを用いることができる。本工程は、これらの未分化iPS細胞を、胚様体の形成を誘導するために用いられる液体培地中で非接着培養することにより行うことができる。本発明において、非接着培養とは、培養容器の底面等(例えば、底面及び壁面)への細胞の接着が抑制された状態での培養を意味する。しては、リン脂質ゲル、ハイドロゲル、微細加工等で低接着表面処理を行った容器等を用いることができる。用いてもよいし、非接着性でない培養容器を用いてもよい。振盪培養をする場合、その方法は特に限定されないが、例えば、図4に示されるようなシーソー型バイオリアクターを用いて行うことができる。振盪培養の傾斜角は、特に限定されないが、水平方向に対して、1°〜40°が好ましく、5°〜35°がより好ましく、10°〜30°がさらに好ましい。振盪培養の振幅は、特に限定されないが、例えば、0.1〜20cm程度であってもよい。振盪の周期は、特に限定されないが、例えば、0.01〜1.00Hz程度であってもよい。図4では、傾斜角は10°であり、振幅は5.5cmである。培養フラスコをのせるテーブル(シーソー型バイオリアクターの部材)の横幅は特に限定されず、例えば、20〜50cm、30〜40cm等の範囲のものを使用することができる。area)が、例えば、5〜200cm2、10〜60cm2、15〜35cm2等の範囲のものを用いることができる。cm2培養フラスコを用いた場合には、1×102〜1×108cells/フラスコ程度が好ましく、1×106〜7×106cells/フラスコ程度がより好ましい。培地としては、霊長類ES/iPS細胞培養用の培地を適宜使用することができる。本発明においてES細胞培養用の培地を単にES培地と示すこともある。MediumあるいはStemFlex培地等が挙げられる。factors)等の成長因子を配合してもよい。これらの成長因子は、1種単独で、又は2種以上を組み合わせて用いることができる。培地には、必要に応じて、幹細胞等の細胞培養の際に用い得る添加剤を配合してもよい。serum)、アミノ酸(例えば、L−グルタミン等)、抗生物質(例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンB等)が挙げられる。本工程における培養時間としては、例えば、約0.5〜3.5日間が好ましく、0.625〜2.5日間がより好ましく、0.875〜1.25日間がより好ましい。本工程における培養時間としては、例えば、約12〜84時間が好ましく、約15〜60時間がより好ましく、約21〜30時間がより好ましい。本工程の培養時間を上記範囲とすることにより、最終的な骨芽細胞塊を袋状でない中実な形状で得ることができるため好ましい。本工程における培養温度は特に限定されず、例えば、30〜42°Cが好ましく、35〜39°Cがより好ましい。本工程における培養は、3〜10%CO2の雰囲気下で行うことが好ましい。培養するのではなく、未分化のヒトiPS細胞を一旦、胚様体に成長させておくことにより、次の中胚葉系細胞に誘導する段階での細胞死を大幅に抑制することができる。実質的に生じさせずに、胚様体の形成まででとどめることを意図する。従って、典型的には、工程(1)で用いる培地として、中胚葉系細胞への誘導剤を含まない培地が用いられる。本発明の方法は、上記工程(1)で得られたヒトiPS細胞の胚様体を非接着培養して、ヒトiPS細胞の中胚葉系細胞への分化を誘導する工程を含む。当該工程に用いる培地としては、中胚葉系細胞の分化誘導に適した培地を適宜使用することができる。;Sigma−Aldrich社製等が挙げられる。これらの培地は、1種単独で用いても、2種以上を組み合わせてもよい。本工程に用いる培地には、中胚葉への分化誘導を促進する観点から、Wntシグナル活性化剤を配合することが好ましい。(7−oxo−β−sitosterol)、IM−12、HLY78等が挙げられ、CHIR99021等が好ましい。これらのWntシグナル活性化剤は、1種単独で用いても、2種以上を組み合わせてもよい。【0044】Wntシグナル活性化剤を配合する場合、その配合量は特に限定されないが、本工程で用いる培地中での最終濃度として、例えば、1〜100μMが好ましく、10〜50μMがより好ましい。本工程に用いる培地には、中胚葉への分化誘導を促進する観点から、ヘッジホッグシグナル阻害剤を配合することが好ましい。ヘッジホッグシグナル阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、シクロパミン、AY9944、GANT58、GANT61、ジェルビン、SANT−1、SANT−2、U18666A、ベラトラミン、ビスモデギブ(Vismodegib)、Cur−61414、ロボトニキニン(Robotnikinin)、JK184、HPI−4等が挙げられ、シクロパミン等が好ましい。これらのヘッジホッグシグナル阻害剤は、1種単独で用いても、2種以上を組み合わせてもよい。【0046】ヘッジホッグシグナル阻害剤を配合する場合、その配合量は特に限定されないが、本工程で用いる培地中での最終濃度として、例えば、1〜100μMが好ましく、1〜10μMがより好ましい。本発明においては、これらのWntシグナル活性化剤及び、ヘッジホッグシグナル阻害剤を両方用いることが好ましい。培養する方法では、細胞塊の形状は中空の袋状となってしまうという新たな知見に基づき、かかる課題を解決すべくさらに改良することにより完成されたものである。従って、胚様体形成の誘導工程の後に、中胚葉への分化を誘導し得る成分としてレチノイン酸のみを配合した培地を用いた培養工程を行う方法は、本発明の方法から除かれる。【0049】また、培地には、必要に応じて、細胞培養の際に用い得る添加剤を配合してもよい。serum)、アミノ酸(例えば、L−グルタミン等)、抗生物質(例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンB等)が挙げられる。【0050】また、培地には、細胞培養に用いる添加剤として、市販の細胞培養用サプリメント等を添加しても良い。Systems社製、BMP4;Peprotech社製が挙げられる。これらのサプリメントは、1種単独で用いても、2種以上を組み合わせてもよい。本発明の方法は、骨芽細胞の細胞塊を製造するための方法である。非接着培養により行われる。非接着培養の具体的な態様としては、前述したものが挙げられる。ウェル、非接着性フラスコ等)を用いた静置培養等が好ましい。本工程における培養時間としては、例えば、0.125〜10日間が好ましく、1〜8日間がより好ましく、3〜6日間がより好ましい。本工程における培養時間としては、例えば、約3〜240時間が好ましく、約24〜192時間がより好ましく、約72〜144時間がより好ましい。本工程における培養温度は特に限定されず、例えば、30〜42°Cが好ましく、35〜39°Cがより好ましい。本工程における培養は、3〜10%CO2の雰囲気下で行うことが好ましい。分化誘導工程を行うことが、ヒトiPS細胞を原料として中実な細胞塊を得るために重要である。本発明の方法は、上記工程(2)で得られたヒトiPS細胞の中胚葉系細胞を非接着培養して、骨芽細胞への分化を誘導する工程を含む。当該工程に用いる培地としては、骨芽細胞への分化誘導に適した培地を適宜使用することができる。pyruvate非含有DMEM培地等);αMEM培地(例えば、ナカライテスク社製αMEM培地)等が挙げられる。これらの培地は、1種単独で用いても、2種以上を組み合わせてもよい。本工程において、培地には、骨芽細胞への分化誘導促進剤等を配合してもよい。骨芽細胞への分化誘導促進剤としては、例えば、アスコルビン酸、β-グリセロリン酸、デキサメタゾン、BMP-2、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、レチノイン酸等が挙げられる。アスコルビン酸は、アスコルビン酸-2-リン酸又はその塩であってもよい。分化誘導剤として、デキサメタゾンに代えて、又はこれに加えて、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾンを用いてもよい。これらの骨芽細胞への分化誘導促進剤は、1種単独で用いても、2種以上を組み合わせてもよい。【0057】アスコルビン酸を配合する場合、その配合量は特に限定されないが、本工程で用いる培地中での最終濃度として、例えば、50〜300μMが好ましく、150〜200μMがより好ましい。β-グリセロリン酸を配合する場合、その配合量は特に限定されないが、本工程で用いる培地中での最終濃度として、例えば、1〜100mMが好ましく、5〜15mMがより好ましい。デキサメタゾンを配合する場合、その配合量は特に限定されないが、本工程で用いる培地中での最終濃度として、例えば、0.001〜10μMが好ましく、0.01〜1.0μMがより好ましい。chloride(CoCl2)等が挙げられる。これらの低酸素模倣化合物は、1種単独で用いても、2種以上を組み合わせてもよい。骨芽細胞の石灰化の観点から、本工程における培地には、スタチン化合物をさらに配合することが好ましい。スタチン化合物としては、例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン及びロスバスタチン等が挙げられる。これらのスタチン化合物は、1種単独で用いても、2種以上を組み合わせてもよい。【0060】また、培地には、必要に応じて、細胞培養の際に用い得る添加剤を配合してもよい。serum)、アミノ酸(例えば、L−グルタミン等)、抗生物質(例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンB等)が挙げられる。本発明の方法は、骨芽細胞の細胞塊を製造するための方法である。非接着培養により行われる。非接着培養の具体的な態様としては、前述したものが挙げられる。本工程においては、振盪培養等が好ましい。本工程における培養時間としては、例えば、約1〜90日間が好ましく、約7〜60日間がより好ましく、約21〜50日間がより好ましい。本工程における培養時間としては、例えば、約24〜2160時間が好ましく、約168〜1440時間がより好ましく、約504〜1200時間がより好ましい。本工程における培養温度は特に限定されず、例えば、30〜42°Cが好ましく、35〜39°Cがより好ましい。本工程における培養は、3〜10%CO2の雰囲気下で行うことが好ましい。本発明は、前述した方法によりヒトiPS細胞から骨芽細胞塊を製造する工程、及び当該骨芽細胞塊を不活化処理する工程を含む、骨再生剤の製造方法も提供する。骨芽細胞塊を製造する工程に用いる原料のヒトiPS細胞について、及び骨芽細胞塊を製造する工程において必要な処理等については前述した通りである。本発明の方法は、上記工程により得られた骨芽細胞塊を不活化処理する工程を含む。凍結乾燥について、条件は特に限定されず、公知の方法を使用できる。凍結乾燥の前に、予備凍結を行ってもよい。予備凍結の温度は、特に限定されないが、例えば、約−12〜−20°Cが好ましい。凍結乾燥温度は、特に限定されないが、約−100〜−5°Cが好ましい。凍結乾燥圧力は、特に限定されず、例えば、600Pa以下が好ましく、50Pa以下がより好ましい。具体的な凍結乾燥条件としては、例えば、温度を−10°Cに固定して凍結乾燥開始と同時に気圧を徐々に5〜20Paまで下げていく方法が挙げられる。以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。BANK社)を用いた。Bradleyより供与)を用いた。pyruvate非含有:ナカライテスク,Cat.#08459−35)〕を用いて培養した。培地交換は2日おきに行った。C(ナカライテスク,Cat.#20898−21)で2.5時間処理し、10cm細胞培養プレート(0.1%ゼラチンコート処理)に1.5×106個/dishの濃度で播種した。Medium(ES培地:REPROCELL,RCHEMD001)を用いて培養した。培地交換は1日おきに行った。IV,10mMCaCl2,20%KSR)を添加して37°Cで1分間処理した後に、CTK溶液を吸引除去し、PBSを1ml添加した。PBSを除去し、培養プレートから剥離したフィーダー細胞のみを可及的に吸引除去した。FGF添加ES培地(RCHEMD001)5mlを用いて回収した。Scientific,Cat.#150239)に移し、1日間静置培養することにより胚様体の形成を誘導した。対照として、胚様体の形成を0日または4日間行った。静置培養を1日間行った後に、iPS細胞胚様体を回収した。Scientific,Cat.#21103−049)の1:1混合培地〕を用いて、あらたな低接着性培養皿上に播種し、5日間の静置培養を行った。対照として、中胚葉分化誘導を行わずに、(1−2)で示した胚様体形成後に、(1−4)に示す骨芽細胞分化誘導を行った。中胚葉分化誘導の評価には、中胚葉のマーカーであるBrachyuryを用いた免疫蛍光染色を行った。胚様体を培養し、両化合物の効果を検討した。pyruvate非含有:ナカライテスク,京都,Cat.#08459−35)〕に交換し、細胞濃度が約1×105〜7×105cells/mlの懸濁液とした。CRAFT)上で振盪しながら、最大60日間非接着培養した。対照として、振盪させずに非接着培養を行った。培地交換は、7日おきに行った。Kossa染色、もしくはOsteocalcinの免疫蛍光染色を施し、組織化学観察を行った。添加して非接着振盪培養した場合の効果を検討した。上記(1−2)、(1−3)に記載の方法によって得られた中胚葉細胞塊において、中胚葉のマーカー(Brachyury)の著明な発現を認めた(図1A)。cyclopamine非存在下でも同様にBrachyuryの著明な発現を認め、中胚葉細胞塊に誘導することができた(図1B)。CHIR99021非存在下では(図1Cおよび1D)、CHIR99021存在下ほど著明ではなかったものの、Brachyuryの発現は認められた。した結果、細胞は袋状の石灰化を示さない細胞構造体となった(図2A)。【0077】そこで、iPS細胞を骨芽細胞誘導する前に中胚葉誘導する方法の有効性を検討した。iPS細胞から直接(ES培地での胚様体形成を行わずに)中胚葉への分化誘導を試みた結果、中胚葉誘導1日後に全てのiPS細胞が細胞死を起こした(図2B)。60日以内に球状の細胞塊を得ることができた(図2C)。60日後では、この細胞塊の内部には、部分的な石灰化像を認めた(図3Aの*印周辺)。工程で、細胞塊を振盪させずに非接着培養を行った場合でも、細胞塊の内部に部分的な石灰化像を認めた(図3Bの*印周辺)。分化誘導した結果、著明に石灰化した骨芽細胞塊を得ることができた(図3Cおよび3D)。30日目には著明に石灰化した細胞塊への誘導を認めた。acid:Sigma)を配合した上記ES培地を用いてさらに2日間培養し、そして上記(1−3)に記載の中胚葉細胞への分化誘導工程を行うことなく、上記(1−4)に記載の骨芽細胞への分化誘導工程を行った。その結果、得られた骨芽細胞様の細胞は、中実の細胞塊ではなく、袋状となった。【0081】(1−7)まとめ以上より、ヒトiPS細胞から三次元的な骨芽細胞塊を作製するためには、胚様体と中胚葉細胞へ分化する工程を含む段階的分化誘導法が必要であることが明らかとなった。おける胚様体培養の期間は、1〜3日が適していることが明らかとなった。スタチン化合物が有効であることが示された。BANK社)を用いた。フィーダー細胞には、SNLP76.7-4細胞を用いた。08459-35)〕を用いて培養した。培地交換は2日おきに行った。dishの濃度で播種した。Medium(ES培地:REPROCELL,RCHEOT002,003)を用いて培養した。培地交換は1日おきに行った。PBSを除去し、培養プレートから剥離したフィーダー細胞のみを可及的に吸引除去した。mlのES培地を用いて回収した。150239)に移し、0〜4日間非接着培養することにより胚様体の形成を誘導した。0〜4日間行った後に、iPS細胞胚様体を回収した。21103-049)の1:1混合培地〕を用いて、あらたな低接着性培養皿上に播種し、5日間の非接着培養を行った。RT−PCR法を用いて検討した。Scientific社)を用いた。RT−PCR法に用いたプライマーの塩基配列は以下の通りである。内部標準にはGAPDHを利用した。CHIR99021あるいはcyclopamineを含有せずに1日間胚様体を培養した場合の中胚葉誘導率について、Brachyuryの免疫蛍光染色を用いて検討した。存在する全胚様体のうち、Brachyury陽性の胚様体が占める割合から求めた。CRAFT)上で振盪しながら、最大30日間非接着培養した。InfraRed:FT-IR)解析を用いて行った。iPS細胞塊をすべて回収し、10%中性緩衝ホルマリン液で固定し、蒸留水で洗浄した後、エタノール(30%,70%,90%,100%)で段階脱水を行った。再度新しいエタノール(100%)を交換した後に、乾燥機中に37°Cで12時間静置した。乾燥した細胞試料に臭化カリウム(KBr)プレート法用いてFT-IR解析を行った。cm−1で積算1000回の赤外線吸収スペクトルパターンを解析した。mm:LifeNetHealth)を用いた。mlのPBSに4°Cで一晩浸漬した。cm細胞培養皿に移し、-80°Cの冷凍庫内で一晩の予備凍結を行った。その後、皿を凍結乾燥機(VD-250R;タイテック)に設置し、一晩の凍結乾燥を行うことで細胞を死滅させ(不活化)、iPS細胞由来骨補填材とした。骨補填材の入っている皿に蓋を被せてシールで密閉し、防湿庫(ガラス製デシケーター)内で保管した。mmの欠損を形成した。頭蓋骨欠損の形成には、動物手術用エンジンおよびトレフィンバー(インプラテックス,東京,Cat.#04949202)を用い、注水下にて行った。凍結乾燥を行ったiPS細胞塊を頭蓋骨欠損部に埋植し、骨膜で被覆して頭皮を縫合した。その後、ラットを特定病原体未感染の条件のもと、飲水および接触が自由な状態で飼育した。よる中胚葉細胞塊の形成の違い1〜4日間の胚様体形成を経た後、上記(2−3)に記載の方法によって得られた中胚葉細胞塊において、胚様体培養期間が4日になると、中胚葉のマーカーであるBrachyuryタンパク質の著明な発現低下を認めた(図6-(4))。1〜3日間の胚様体形成を経た後の中胚葉細胞塊では、Brachyuryタンパク質の発現が上昇した(図6-(1)〜(3))。ための非接着培養を0日とした場合、細胞は死滅してしまった。【0092】また、0.5〜3日間の胚様体形成を経た後、上記(2−3)に記載の方法によって得られた中胚葉細胞塊では、Brachyury遺伝子の発現が上昇した(図7)。胚様体培養期間が1〜3日の場合では0.5日の場合と比較して、Brachyury遺伝子の発現は有意に上昇し、特に1日の場合に最も高い発現を示した(図7)。上記(2−2)、(2−3)に記載の方法によって1日間胚様体形成を行った後に中胚葉細胞へ分化誘導した場合、分化誘導後の中胚葉細胞塊における中胚葉のマーカー(Brachyury)遺伝子の発現は、分化誘導前と比較して約1500倍増加した(図8)。この時、中胚葉への誘導率は83%であり、cyclopamine非存在下でも57%、CHIR99021非存在下でも40%の中胚葉誘導率を示した(図9)。CyclopamineおよびCHIR99021非存在下では中胚葉誘導率は17%に留まった。した細胞塊のFTIR解析を行った結果、アミノ酸の豊富な基質(アミドIおよびアミドII)の中にハイドロキシアパタイトに関連するリン酸基(P)および炭酸アパタイトに関連する炭酸基(C)の存在を示唆するピークが出現し(図10:矢印)、ヒト凍結乾燥骨(FDBA)と同じ赤外線吸収スペクトルパターンを示した(図10)。新生骨の形成を認めた(図11-(1),(2))。炎症細胞の集積や腫瘍化を示す異常所見は認めなかった(図11-(2))。【0096】(2−8)まとめ以上より、ヒトiPS細胞から三次元的な骨芽細胞塊を作製するためには、胚様体と中胚葉細胞へ分化する工程を含む段階的分化誘導法が必要であることが明らかとなった。おける胚様体培養の期間は、0.5〜3日間が適しており、1日が最も適していることが明らかとなった。ヒト凍結乾燥骨(FDBA)と同様の成分を有し、ラット頭蓋骨欠損モデルにおいて新生骨の形成を促進することが明らかとなった。【請求項1】ヒトiPS細胞から骨芽細胞塊を製造する方法であって、(1)未分化ヒトiPS細胞を0.5〜3.5日間、非接着培養して、胚様体の形成を誘導する工程、(2)上記工程(1)で得られたヒトiPS細胞の胚様体を非接着培養して、ヒトiPS細胞の中胚葉系細胞への分化を誘導する工程、及び(3)上記工程(2)で得られたヒトiPS細胞の中胚葉系細胞を非接着培養して、骨芽細胞への分化を誘導する工程を含む方法であって、前記工程(2)における培養が、Wntシグナル活性化剤及びヘッジホッグシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも一種の存在下で行われる、方法。前記工程(1)における、培養時間が0.625〜1.25日間である、請求項1に記載の方法。前記Wntシグナル活性化剤が、CHIR99021、6−ブロモインディルビン−3’−オキシム、ケンパウロン、SB−216763、SKL2001、デオキシコール酸、WAY−316606、NSC−693868、リシニン、7−oxo−β−シトステロール、IM−12及びHLY78からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項1又は3に記載の方法。前記ヘッジホッグシグナル阻害剤が、シクロパミン、AY9944、GANT58、GANT61、ジェルビン、SANT−1、SANT−2、U18666A、ベラトラミン、ビスモデギブ、Cur−61414、ロボトニキニン、JK184及びHPI−4からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項1、3及び5のいずれかに記載の方法。スタチン化合物からなる群より選択される少なくとも一種の存在下で行われる、請求項1、3、5及び6のいずれか1項に記載の方法。Reserved.11。