2018.背景ジストロフィン遺伝子はX染色体に位置し、ジストロフィンタンパク質はジストロフィン遺伝子1コピーからでも発現する。したがって、1コピーの変異に対して少女にはバックアップが備わっているが、少年の場合はバックアップが無く、若年で歩行困難になり、平均して20台半ばで心臓と呼吸器の不全により死に至る。DMD患者の少年の13%がエクソン45と50の間の領域に変異を帯び、そのために、エクソン51の読み枠が壊れている。PiercyはDMDの兆候を呈するスパニエルにおいて、エクソン51の読み枠が壊れていることを同定していた。2016年にFDAよって認可されたが、2018年3月に欧州医薬品庁の委員会は非承認を勧告した。詳細DMDの犬モデルの一種であり、ヒトDMD遺伝子の変異ホットスポットに対応するエクソン50を欠損しているdeltaE50-MD犬4頭に1月齢で、エクソン51のスプライス受容部位を標的とするsgRNA-51とCas9をそれぞれ組換えAAV9で送達した。ジストロフィン・タンパク質のレベルが筋肉の種類に応じて正常ジストロフィン遺伝子の3~90%まで回復し(横隔膜では58%)、心筋では最も高い用量を施した場合に92%まで回復した。CRISPR遺伝子編集による筋肉組織の改善も見られた。DEPTHの記事は、Olsonグループらの成果を簡明に紹介し、CRISPR/Cas9遺伝子編集によるDMD遺伝子治療が前進しているとしつつ、以下のような問題点も指摘した:今回の報告に対しては、例数が少ないことや、DMDの表現型のデータがほとんどないことを問題とみる研究者もいる。骨格筋は常に更新されるため必要とされる投与の繰り返しを、幹細胞でのジストロフィンタンパク質発現の回復により回避する工夫が必要である。CRISPR遺伝子編集が発癌性変異を誘導するか見るために長期的観察が必要である。療法として認められたとしても、DMDによる筋肉の損傷は非可逆的なため、DMD発症早期に処方する必要がある。pyogenes由来Cas9(SpCas9)によるゲノム編集は、ゲノムDNA上のNGG配列に縛られている。SpCas9は、NGGをPAM(プロトスペーサー隣接配列)として認識することで標的部位を切断する。そこで、NGG縛りを緩めて標的可能領域を広げるために、SpCas9への変異導入によるPAM配列改変や、異なるPAM配列を認識するCasタンパク質の探索が試みられてきた(関連crisp_bio記事参照*)。Broad研、McGovern研ならびにMITの研究チームは今回、PAM配列NGをPAMとして認識するSpCas9変異体(SpCas9-NGと命名)を合理的に設計・作出し、その編集機能ならびに構造基盤を明らかにした。Jinekらの先行研究において、SpCas9は、そのArg1333とArg1335でPAM配列NGGの2番目と3番目のGを認識することが明らかにされていた。欠損させ、一方で、SpCas9とPAM二重鎖との間に塩基非特異的な相互作用を導入することで、SpCas9のNGG縛りを緩めることを試み、NG配列をPAMとして認識するSpCas9-NGに至った。vitroで確認した。Ala1322ならびにThr1337をアルギニンに置換することで、SpCas9変異体の切断活性が部分的に復活することを見出しR1335A/L1111R/G1218R/A1322R/T1337R変異体(以下、ARRRR)がTGGを帯びたプラスミドを効率的に切断することを確認した。(以下、VRVRFRR)に至った。TGTおよびTGCを伴う標的をより効率的に切断することを見出した。SpCas9とSaCas9よりも低いがAsCas12aおよびLbCas12aと同等であった。SpCas9がNGGを特異的に認識し、VRVRFRRがNGを認識することを確認した。PAMsよりも低いことを確認した。PAMsを帯びた標的に対して、xCas9に優る認識と切断活性を示した。(E1219F)とPAM二重鎖の糖‐リン酸主鎖との相互作用などを同定した。c-mycおよびサイクリンD1の過剰発現、加えて、基底膜の破壊に至る浸潤が亢進BE腫瘍をドライブする他のパスウエイについても、今回の手法により、不死化または癌細胞由来細胞モデルに見られるシグナル伝達におけるノイズの擾乱を受けない評価が可能。(CRISPR-C)ことを実証した。CRISPR-Cにより、異なる遺伝子座においてサイズの異なる環状DNA生成が可能であり、第18染色体からの47.4メガベースのサイズの環状染色体作出も実現した。癌のほぼ半分は癌遺伝子とeccDNAsを帯びており、また、環状染色体が病因となる遺伝子疾患が知られており、CRISPR-Cはヒト疾患研究に有用である。CRISPR-Cはまた、染色体・ゲノム合成研究にも有用である。分裂終了後グリア細胞において、AAVでHDRテンプレートを送達することでHDR過程を介した効率的な配列ノックインが可能なことを示し、vSLENDR法と命名した。24.再生医療に必要な細胞分化には、複数の転写因子それぞれにウイルスベクターを用意し、また、長時間の遺伝子過剰発現のためにウイルスベクター送達を繰り返す必要があった。近年、CRISPR-Casシステムによって、不活性なCas9タンパク質(dCas9)にエピゲノム調節因子または転写調節因子を融合し、gRNAで標的位置に誘導することで、内在遺伝子発現の活性化と抑制を簡便に制御することが可能になった。CRISPR-dCas9に基づく手法、および、その幹細胞からの細胞分化または成熟細胞の直接変換を介した目的細胞作出への応用を概観し、再生医療と疾患モデリングへの応用を展望。1.76億人(PopulationPyramid.net)の人々に囲まれて、800万人の科学者が研究に携わっている(UNESCO統計)。Crazinessの中の一文を意訳し数字を改訂)。Barrangouのエッセイ。ヒトはSpCas9とSaCas9に対する抗体を帯びている一般的に、細胞内の外来タンパク質は細胞性免疫、特に、CD8陽性細胞傷害性T細胞(CTLs)を介して、細胞死を誘導するが、外来タンパク質に対する抗体が直接に細胞死を誘導することはない。Charlesworthらが報告したCas9反応性CD8陽性T細胞は、インターフェロンγを分泌し細胞死を誘導することが示唆される。ヒトの細胞性免疫が、CRISPR-Cas9が修復した細胞を破壊することを意味する。AAVのような非炎症性ベクターを利用した遺伝子治療を施した動物モデルでは、未だ、Cas9に対する免疫応答がCas9を発現細胞を細胞死に誘導する例は見出されていない。したがって、Cas9に対する免疫の内在いかんにかかわらず、Cas9発現が形質転換した細胞を破壊するか否か定かではない。T細胞の影響を最小限に止める戦略が複数あり、この点で、遺伝子編集の分野は遺伝子治療の分野に学ぶことができる。ルート、プロモーター、および免疫抑制を注意深く分析・調節することで、カプシドや外来遺伝子に対するCTLの問題を克服してきた。Cas9の発現を恒常的ではなく一時的に発現させてCTLの問題を回避する手法も今後の開発・改良を期待できる。免疫能を備えた大型動物モデルによる前臨床試験が必要であるが、遺伝子編集の未来に陰りは見えない。(BCL-2ファミリータンパク質阻害剤)が抗がん剤として有望であるが、各種癌のBCL-2遺伝子依存性の理解は進んでいなかった。MCL-1の阻害剤およびその組合せに対する10種類の組織型の癌の感受性を判定し、CRISPR/Cas9スクリーンによって、BCL-wとBFL-1が、BH3ミメティクスの全ての組合せに対する耐性を亢進することを同定。29.プロモーターの異常なメチル化による特定の遺伝子の発現抑制による臓器の線維化が進むが、その遺伝子を特異的に再活性化する療法は実現していなかった。TET酵素は、メチル化されたDNAをヒドロキシメチル化を触媒し、遺伝子発現を再活性化する。vitroにて、腎線維症において高度にメチル化されているRASAL1とKlothoを含む4種類の抗線維化遺伝子の再活性化を実現した。vivoにて、Rasal1を標的とするdHFCas9-TET3CDをレンチウイルスを介して間質細胞へ送達し、また、Klothoを標的とするdHFCas9-TET3CDを尿細管上皮細胞に送達し、いずれも目的遺伝子発現の再活性化と繊維化の抑制を実現した。Puroを添加した培養条件で非分化状態で数週間維持する。この長期間の培養期間を活かして、遺伝子の過剰発現やCISPR/Cas9によるノックアウトを複数回加えることが可能である。遺伝子編集の結果から、遺伝子改変が誘導された細胞をFACSで選別する。DC)へと分化させる。DCは、T細胞の増殖を誘導し、CCR7依存のリンパ節への遊走性を示した。vivoリアルタイム可視化を実現。GRAs)が必須とされている。変異型と野生型の表現型と遺伝子発現プロファイルを比較した。vivoでも、見られなかった。GRA遺伝子またはGRA遺伝子間の協働によることが示唆された。gondiiの細胞周期とジェノタイプに依存することも見出した。VPRを利用し、ヒト胎児腎由来HEK293A細胞とラットのミュラーグリア由来rMC1細胞において遺伝子活性化を検証。Neurod1およびNrl遺伝子の発現も、HEK293A細胞より効率が低くかつ変動するが活性化された。(ChIP-seq)によりRCSE候補を同定し、抑制型クロマチン構造を形成する複合体Sin3AとdCas9を融合したエピジェネティック抑制と3C法によってRCSEを特定した。CRISPR/Cas9でRCSEを欠失させたマウスはACD様表現型を呈した。CRISPR/dCas9-ChIp-質量分析により、STAT3がSox9エンハンサーをトランス活性化する因子であると特定した。RCSEが肋軟骨特異的であることもX-gal染色体法により確認した。crisp_bioTweet2018年08月28日タンパク質の細胞内分解速度は、細胞周期で変動し、細胞間でも変動する。23.[概要]正常な生細胞ではタンパク質の合成と分解とが同時進行しつつもプロテオームが然るべく制御されている。今回、スイスEPFLの研究チームはマウスES細胞において、40種類の内在タンパク質を対象として、その合成速度と分解速度をトランスクリプトミクスに依存することなく直接測定し、タンパク質の合成と分解がプロテオームを制御する分子機序を論じた。labeling)とタイムラプス・イメージングを利用したタンパク質分解速度測定も実施[結果]G1期とG2期の間でタンパク質合成速度が大きく変動する。細胞分裂時に多くのタンパク質の分解速度が低下し、~40%のタンパク質のレベルが安定する。ES細胞においても線維芽細胞でも、細胞ごとにタンパク質分解速度が大きく変動するが、同一細胞内では異なるタンパク質の半減期が共変動する。細胞ごとのタンパク質分解速度とタンパク質合成速度とが正に相関し、結果的に、細胞ごとのタンパク質発現レベルの変動が抑制される。タンパク質分解速度の細胞間の変動は、プロテアソームの因子であるプロテアソームユビキチン受容体ADRM1の発現レベルと相関し、遺伝子特異的なタンパク質分解速度とは独立である。