FavoritesSummaryこの研究は、適切な暴露方法から胚処理およびエタノール分析へのヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚のエタノールレベルを定量化するプロトコルを記述する。here.Abstract胎児アルコールスペクトル障害(FASD)は、顔面変形および神経障害を含むエタノール誘発発達欠陥の非常に可変的な連続体を記述する。複雑な病理を持つFASDは、毎年米国で生まれた約100人に1人の子供に影響を与えます。FASDの非常に可変的な性質のために、動物モデルはエタノール誘発開発欠陥の私達の現在の機械論的理解の重大な証明された。ゼブラフィッシュを使ってエタノールによる発達欠陥を調べることに焦点を当てた研究室が増えています。引っ張り可能な半透明の胚を多数産生する。これにより、研究者は複数の遺伝的文脈でエタノール暴露のタイミングと投与量を正確に制御し、ライブイメージング技術を通じて胚性エタノール暴露の影響を定量化することができます。これは、遺伝学とヒトとの発達の両方の高度な保全と相まって、ゼブラフィッシュがエタノール催奇性の機械学的基礎を研究する強力なモデルであることが証明されている。エタノール暴露レジメンは、これらの研究全体でゼブラフィッシュデータの解釈を混乱させている異なるゼブラフィッシュ研究の間で変化している。ここでは、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚のエタノール濃度を定量するプロトコルを示します。Introduction胎児アルコールスペクトル障害(FASD)は、胚性エタノール暴露1に関連する幅広い神経障害および頭蓋顔面異形について説明する。エタノール暴露および遺伝的背景のタイミングと投与量を含む複数の要因は、FASD2、3の変動に寄与する。人間では、これらの変数の複雑な関係は、FASDの病因を研究し、理解することは困難です。動物モデルは、エタノール催奇形性の機械論的基礎に関する我々の理解を深める上で極めて重要であることが証明されている。多種多様な動物モデルシステムがFASDの複数の側面を研究するために使用されており、結果はヒト4の暴露に見られるものと著しく一致している。げっ歯類モデルシステムは、マウスが最も一般的な5、6、7である、FASDの多くの側面を調べるために使用されます。この研究の大半は、初期エタノール暴露8に対する発達欠陥に焦点を当てているが、エタノールへの後の暴露は、同様に9の発達異常を引き起こすことが示されている。マウスの遺伝的能力は、FASD10,11の遺伝的基盤を調査する能力に大いに役立っています。19,20,21.これらの研究は、動物モデルがFASDとその根本的なメカニズムに関する我々の理解を進めるために重要であることを示している。ゼブラフィッシュは、エタノールの多くの側面を調べる強力なモデルシステムとして登場しました22,23.外的受精、高い胎児性、遺伝的な管への影響、および生きている画像化能力のために、ゼブラフィッシュは、エタノールのテラトジェネシスのタイミング、投与量、遺伝学などの因子を研究するのに理想的です。エタノールは、正確にステージされた胚に投与することができ、胚を画像化して、発生過程におけるエタノールの直接的な影響を調べることができます。開発の遺伝的プログラムはゼブラフィッシュとヒトの間で高度に保存されているため、FASDのヒト研究を導くのに役立つため、この研究は、ヒトに直接関連することができます24.ゼブラフィッシュはエタノールのテラトジェネシスを調べるために使用されてきたが、胚エタノール濃度を報告する際のコンセンサスの欠如は、ヒトとの比較を困難にする25.哺乳類システムでは、血中アルコール濃度は組織エタノールレベル26に直接相関する。ゼブラフィッシュ研究の多くは、循環系の完全な形成前に胚を治療する。検査する母体試料が存在しない場合、胚内のエタノール濃度を定量化するにはエタノール濃度を評価するプロセスが必要です。ここでは、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いて、現像するゼブラフィッシュ胚中のエタノール濃度を定量するプロセスについて説明する。librarian.Protocolこの手順で使用されるすべてのゼブラフィッシュ胚は、確立されたIACUCプロトコル27に従って飼育および飼育された。これらのプロトコルは、テキサス大学オースティン校とルイビル大学によって承認されました。注:ゼブラフィッシュラインTg(fli1:EGFP)y1は、この研究で使用されました28.この手順で使用されるすべての水は、滅菌逆浸透水である。すべての統計分析はグラフパッドプリズムv8.2.1を使用して行われました。Oの4.9gを1Lの水に溶解させる。形成される白色の沈殿物は無視してください。これはメディアに影響しません。ストック液をフィルター殺菌し、4°Cで保管します。28°Cで働く胚培地溶液を維持する。このプロトコルでは、24時間の受精後(hpf)胚(図1)が使用されます。体積測定に使用される胚は、エタノール分析には使用されません。mLマイクロ遠心管に10個の胚と胚外液を250μLの体積で印を付けます(図2A)。Bの染水を使用したサンプルを参照)。繰り返して、そのコーションを除去した胚のレセプタクルを設定します。絨毛膜を取り除くために、室温(RT)の室温(RT)で2mg/mLのプロテアーゼカクテルを含む100mmペトリ皿に胚を100mmペトリ皿に入れます。数分ごとに、静かに絨毛を壊すために胚を渦巻きます。すべての胚が絨毛から解放されたら、プロテアーゼカクテル/胚培地からデコリオネートされた胚を取り除き、新鮮な胚培地を含む新しい100mmペトリ皿に入れて胚を洗浄する。胚を新鮮な100mmペトリ皿に移します。mgの精度のスケールで水の重量を量る。10個の胚のサンプルの体積を決定するために、250μLから取り出した水の重量/体積(水の1mL=1g)を減算します。μLと除去された水の重量の差を10で割ります。エタノールで胚を処理する交配タンクから胚を集め、標準的な100mmペトリ皿に入れます。1ペトリ皿あたり100個以下の胚を数え、28.5°Cでインキュベートしてください。注:コリオンを除去する場合(ステップ2.2)、エタノールを添加する前に除去する必要があります。hpfで、胚培地または胚培地+1%エタノール(v/v)を含む新しい標準100mmペトリ皿に最大100個の胚を加える。蓋をするが、ペトリ皿を密封しないでください。°Cに設定された低い臨時インキュベーターに胚を置きます。NaCl(サンプルチューブあたり450μLが必要)の溶液を作ります。胚培地中の2mg/mLの濃度でプロテアーゼカクテル(材料表)を作ります。各サンプルに1.5mLマイクロ遠心チューブと2mLガスクロマトグラフバイアルをラベル付けします。mLガスクロマトグラフバイアルをラベル付けします。p200マイクロピペットを2つ50μLに設定し、3つ目は200μLに設定します。p1000マイクロピペットは450μL、p2マイクロピペットは2μLに設定されています。mLマイクロ遠心管チューブに胚を移すために使用されるガラスピペットの場合、ピペットチップを素早く炎を通して通過させ、ピペットに引き込むときに胚を損傷しないように端を滑らかにします。注:その合唱中の胚と以前にそれらの塩素から取り除かれた胚の両方は、希釈因子の計算における一貫性のために同じように扱われる。μLに設定された2つのp200マイクロピペットを使用して、プロテアーゼカクテル溶液を1つに50μL引き込み、50μLの水を2番目に引き込みます。mLマイクロ遠心管内に10個の胚(ステップ3.2から)をすばやく入れ、キャップを閉じます(図2Aに記載)。検査対象のすべてのサンプル、コントロール、エタノール処理された胚について繰り返します。μLに設定されたp200マイクロピペットを使用して、キャップを素早く開き、残りの胚培地をすべて取り除きます(図2Cに記載されています)。50μLの水を含むピペットをチューブに素早く入れ、素早く(胚に損傷を与えないように)加え、水を取り除きます。待機中のピペッタから50μLのプロテアーゼカクテル溶液を素早く追加し、チューブキャップを閉じます(図2D)。サンプルをRTに10分間座らせて、プロテアーゼカクテルが絨毛膜を分解できるようにします。サンプルを10分間ボルテックスします。処理を高速化するには、ミキサーをセットアップして複数のサンプルを同時に回転させます。hpfより古い胚を持つチューブにシリカビーズ混合物(2サイズ、0.5mmおよび1mmビーズ)の少量(約100μL)を加えます。古い胚では、脊索は均質化される期間に関係なくそのまま残ります。μLの均質化された胚上清を素早く除去し、ガスクロマトグラフバイアルに加えます。バイアルをポリテトラフルオロエチレンキャップで素早く密封します。NaCl/プロテアーゼカクテル溶液でメディアを10倍に希釈します。各サンプルの2μLをガスクロマトグラフバイアルに加え、ポリテトラフルオロエチレンキャップで密封します。NaCl/proteaseカクテル溶液中に100%エタノールの連続希釈液を作成し、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、および40mMの濃度にします。ガスクロマトグラフバイアルに各標準の2μLを加え、ポリテトラフルオロエチレンキャップで密封します。ヘッドスペースガスクロマトグラフの準備メモ:このセットアップとプロトコルは、使用するガスクロマトグラフに応じて変更する必要があります。ヘッドスペースガスクロマトグラフィーは、分離のためではなく、エタノールレベルを定量するために使用されます。オートサンプラーのヒーターを58°Cに設定し、電源を入れます。ヒーターが58°Cに達し、ガスクロマトグラフを供給する空気と水素ガスラインをオンにします(エタノールを定量するために使用される炎イオン化用)。メモ:psiは、メーカーの仕様に従ってクロマトグラフを正しく動作するように設定する必要があります。ヘリウムラインがオンで、適切なpsiに設定されていることを確認します。指定していないことを確認します。以下ではないことを確認してください。サンプルを実行する前に変更する必要があります。解析ソフトウェアの電源を入れ、ワークステーションが正しくセットアップされていることを確認します。ラボ/部門の基準に従ってすべてのデータを保存します。起動方法を開始し、サンプルを実行する前に炎イオン化検出器が安定するのを待ちます。安定したら、ソフトウェア起動方法を実行してファイバをクリーニングします。つの新しい行を作成します。3分rgラン2_5min吸収する。NaCl/プロテアーゼカクテルブランクから始めて、サンプルリストに記入してください。mMまでの順に規格を入力します。NaCl/プロテアーゼカクテルブランクの第2ラウンドで基準に従ってください。試験されるすべての均質化された胚上清サンプルを、最も低いものから最高の予測エタノール濃度まで入力します。NaCl/プロテアーゼカクテルブランクの第3ラウンドと最終ラウンドに入ることによって終了します。サンプルが入力された順序で、オートサンプラーにガスクロマトグラフバイアルを追加します。すべてのサンプルと最後のブランクが実行されたら、サンプル・リストに最終サンプルを追加してスタンバイを実行して、ソフトウェアのシャットダウン方式をアクティブにします。METH.サンプルの実行中に取得したすべてのデータをバックアップします。オートサンプラーヒーター、水素タンク、クロマトグラフ温度が30°Cに達した後にのみ、空気タンクの電源を切ってください。ワックスカラムを保存するためにヘリウムタンクをオンのままにします。ファイルで計算されました。結果を含むフォルダを開きます。サンプルは、このプログラムに自動的に統合されます。結果では、正しいピークが統合されていることを確認します(エタノールピークは2~2.5)。すべてのサンプルが確認されたら、結果を印刷またはエクスポートします。エタノール規格のピーク高さをグラフにプロットします。する必要があります)。これらの値は、サンプルピーク高からエタノール濃度を決定するために使用されます。各サンプルについて、エタノール規格のY切片からサンプルのピーク高さを引きます。この値をエタノール規格の傾きで除算し、GCバイアル中の各サンプルのエタノール値を求める。胚中のエタノール濃度を計算するために、まず各サンプルの希釈倍率を計算する。このプロトコルのステップ2.3で計算された体積測定を行い、体積測定値に500μLを加えた値で割ります。NaCl/プロテアーゼカクテル溶液を表します(ステップ5.3および5.4)。このサンプル希釈倍率を用いて、各サンプルのサンプルエタノール値を掛ける。結果はmM濃度になります。メディアエタノール値に希釈率10を掛けて、メディア参照サンプルを計算します。Results血中エタノール濃度は、完全に形成された循環系を欠いているため、初期の胚ゼブラフィッシュでは決定できません。ゼブラフィッシュ胚中のエタノール濃度のレベルを決定するために、エタノールレベルは均質化された胚組織から直接測定される。胚性エタノール濃度を適切に測定するには、胚量を考慮する必要があります。胚(卵黄付)は、胎児の体液で囲まれた絨毛膜(卵殻)の中に位置しています(図1)。胚の体積測定は、胚のサイズが大きくなるにつれて発生時間にわたって胚の体積が変化するため、暴露時に胚に対して行われなけである。これらの要素の両方が胚性エタノールレベルを計算するために使用される希釈因子を作成するので、胚の処理方法は、胚量と同様に考慮する必要があります。胚は完全な球体ではないので、特に10hpfの後、水の変位は胚の体積を評価するために使用された。hpfで胚を使用しました。絨毛膜の胚量と絨毛膜から取り出された胚の体積を測定した。これらの体積は、胚外液を有する胚に対して1.97(±0.4SD)μL、胚単独で1.1(±0.22SD)μLであった(表1)。この胚の胚と胚外液単独の違いは、絨毛膜内の胚を取り囲む胚外液の体積である(図1)。この差は、試料中の胚単独のエタノール濃度を決定する上で重要である。分析から、胚は絨毛膜内の胚外液を有する胚の体積の合計の56%を含んだ(表1)。胚が成長するにつれて、胚量は時間の経過とともに増加し、その結果、胚外液25の体積が減少した。絨毛膜にある胚からのエタノール濃度を測定する場合、胚と胚外液の両方の水分含有量を考慮する必要があります。以前に発表された研究は、胚単独の水分率が73.6%29であることを示している。組み合わせを用いて得られた。この結果を確認するために、胚は、前に説明したように、70°Cで焼成前後に単独で計量した。このプロセスは、胚からすべての水を除去します。重量の変化は、胚中の水の量を表す。この分析から、24hpf胚には〜72%の水が含まれ、48hpf胚は〜76%を含んでいた。これらの値はいずれも、以前に計算された73.6%の胚性水量29と非常に類似している。これは、初期の発達を通じて胚の水量がほとんど変化しにくいということを示唆している。胚の水量を計算するために複数のアプローチを使用して公開された研究に基づいて、73.6%が提示されたすべての分析の胚性水分含有量として使用されました。この結果、胚体積の1.1μLの0.82μLを含む水が得られた(表1)。この結果、胚外液の体積は0.86μLと計算した。胚外液を有する胚の総水量のうち、49%が胚に含まれ、51%が胎児外液に含まれる(表1)。ガスクロマトグラフィー分析では、その絨毛膜に残っている24hpfの胚だけが使用された(図1)。mM)の胚を処理しましたが、実験設計に応じて異なるエタノール濃度と露光時間窓を使用できます。15個のサンプル(1サンプル当たり10個の胚)とそれらが2つの異なる実験日にわたって処置した培地(表2)の2つのグループを分析した。メディアレベルは実験によって異なる場合があります。これを説明するために、培地エタノールレベルは、実験群当たり5倍に測定した。使用して大きく異なります。その濃度は、胚外液を有する胚の2群間で有意に異なっていなかった(非対化t試験、p=0.07)。未処理のコントロール胚を0mMで測定した。培地レベルの変動により、各試料のエタノール濃度/培地濃度の比率を求めて算出した。グループ1はメディアエタノールレベルの44%を有し、グループ2は媒体エタノールレベルの40%を有していた(図3および表2)。図1:絨毛膜内の24時間の受精後(hpf)における胚の画像。胚と黄身は、すべての絨毛膜の内側に位置する胎児外液に囲まれています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。hpf胚が250μLの体積でマークされた1.5mLマイクロ遠心管チューブに移された。水で満たされた胚を有するマイクロ遠心管(水を染めるので、250μLのマークで見やすい)。すべての水をチューブから取り出し、計量します。マイクロ遠心管に移した10個の胚。水を(C)のように除去し、50μLのプロテアーゼカクテルに置き換えた。NaClを(D)からチューブに添加した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。図3:試料のエタノール濃度と媒体の比率の箱ひげ図各群のエタノール濃度を、その群の培地サンプルの平均で割った。15;サンプルあたり10個の胚。<0.0001)と一方向の分散分析を使用して比較されました。ひげは最小値から最大値を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。Ya胚性水量は、ハゲドーンら29から計算した。b値は±標準偏差(SD)として報告されます。表1:胚の胚の水量を、胚外液で計算する。hpf胚と絨毛膜から取り除かれた胚から13サンプル(サンプルあたり10個の胚)から計算された。値は平均値±SDとして報告されます。Ma値は±SDとして報告されます。表2:胚外液および培地(mM)のエタノール濃度の計算。メディアサンプルは、メディアからの直接的な測定(グループ当たりn=5)であった。胚エタノール濃度は、胚外液を有する24hpf胚から15サンプル(サンプルあたり10個の胚)から計算した。胚のエタノール濃度と胚の胚外液と培地の比率を算出した。値は平均値±SDとして報告されます。b値は±SDとして報告されます。表3:胚中のエタノールの計算胚エタノール濃度は、胚の全エタノール濃度の56%を胚外液で計算した。これは、その後、メディアに対する胚の比率として報告されました。値は平均値±SDとして報告されます。librarian.Discussion開発モデルシステムとして、ゼブラフィッシュは環境要因が開発に及ぼす影響を研究するのに理想的です。彼らは、エタノール研究で正確なタイミングと投与パラダイムを可能にする外部受精胚の多数を生成します。これは、ライブイメージング能力と人間との遺伝的および発達的保全と組み合わせることで、ゼブラフィッシュを気象学研究のための強力なモデルシステムにします。記載されているは、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚を開発する際の胚性エタノール濃度を測定するためのプロトコルである。胚性エタノール濃度を決定することは、エタノールが発達中の胚に及ぼす影響を理解する上で重要です。げっ歯類モデルでは、血中エタノール濃度は組織濃度26に相関する。ゼブラフィッシュの初期胚発生における血中エタノール濃度を評価することは不可能である。ヘッドスペースガスクロマトグラフィーは、ゼブラフィッシュ25、30、30、32、33、34、35を含む様々な実験パラダイムにおけるエタノールレベルを測定するために使用されている。このプロトコルは、これらの様々な要因の揮発性が定量的に測定するのに十分高くする必要があり、ガスクロマトグラフカラムを問題の化合物の極性に基づいて選択する必要があるにもかかわらず、多くの異なる環境要因を測定するために使用することができます。ゼブラフィッシュは、水溶性因子への暴露は魚類で分析することが非常に困難であるため、水溶性因子の影響を研究するのに最も適しています。このプロトコルは、研究者がゼブラフィッシュ胚のエタノール濃度を直接評価することを可能にする。胚性エタノール濃度の正確な測定を確実にするために、いくつかの要因に対処する必要があります。全胚組織中のエタノール濃度を測定したため、胚量を考慮する必要がありました。10hpf後、胚は、ソミトジェネシス(サマイト形成)を開始し、もはや球ではない(図1)。胚量を評価するために、サンプルあたり10個のプールされた胚に水変位を使用した。各サンプルは、10個の胚で構成され、まず、少量のピペットからの誤差を減らし、第2に、胚量の小さな変動を平均化する。胚量を測定する場合、ピペッティングと計量の精度を考慮することが重要です。サンプルあたり10個の胚の使用でさえ、ピペットと胚の重量を量るために使用されるスケールの両方の精度の下限にあります。利用可能な機器では、10個未満の胚を使用すると、分析に影響を与えた可能性があります。これは、機器の精度が考慮される限り、研究者がサンプルごとにより少ない胚を使用するのを制限するものではありません。胚量は、サンプル分析に影響を与える1つの要因です。第二の重要な要因は、エタノールが揮発性であるため、胚の処理速度です。エタノールは複数の動物実験25、36、37で素早く平衡化する。当社の洗浄プロトコルは、絨毛膜の外面に付着するエタノールを迅速に除去するように設計されています。この研究では、この洗浄プロトコルは胚性エタノールレベルに影響を与えなかったが、より長いまたは複数の洗浄は胚性エタノール濃度25、38に影響を与える可能性がある。考慮に入れる第3の要因は、処理中の胚量の希釈である。NaClを分解するためにプロテアーゼカクテルを使用しています。最後に、さまざまなゼブラフィッシュ研究において、さまざまな分析と報告方法が説明されています。使用する方法は、二次代謝産物の分析に依存します。その場合、酵素活性の速度は変化し、エタノール濃度の正確な分析を妨げる可能性があります。この方法はエタノール濃度を直接測定し、エタノール濃度は、胚と培地濃度の比率として報告される。我々の結果は、培地濃度の約30%を含む24hpf胚のコンセンサスの増加に沿ったものである(表3)25、38、39、40)。驚くべきことに、この30%胚エタノール濃度は培地濃度とは無関係であり、この平衡25,38を作り出すものはよく分かっていない。hpf胚25のエタノール含有量のほぼ半分を含む。我々の結果はエタノール-水平衡を決定しない。エタノールが平衡化する速度とエタノールの揮発性を考えると、エタノール暴露による胚自体の水量変化を評価することは非常に困難です。水変位を使用してエタノール処理された胚サンプルの体積を測定しようとすると、測定中に胚からのエタノールが失われます。上述のものよりもより正確な顕微鏡法および分光法を用いて、両者を同時に直接測定することにより、胚内のエタノール-水平衡を決定することができるかもしれない。全体的に、ここで説明するプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の発生における胚エタノール濃度を評価するための強力なツールです。この情報は、ゼブラフィッシュを用いたFASD研究の標準化に重要です。エタノール処理パラダイムを正確に制御し、胚性エタノール濃度を直接定量化する能力は、ヒトFASD研究のためのゼブラフィッシュモデルの機能を強化する。最終的には、この作業はFASDに対する我々の理解を大幅に向上させるでしょう。librarian.Disclosures著者たちは開示するものは何もない。(NIH/NIDCR)R01DE020884からJ.K.E.への以前の助成金によって支えられていました。国立衛生研究所/アルコール乱用・アルコール依存症研究所(NIH/NIAAA)F32AA021320からC.B.L.への、国立衛生研究所/国立アルコール乱用研究所(NIH/NIAAA)R00AA023560からC.B.L.ガスクロマトグラフ分析を提供し、支援してくれたルーベン・ゴンザレスに感謝します。ティアナ・オンティヴェロスとジーナ・ノーブルズ博士の執筆支援に感謝します。gdpr@jove.com.。