2.1(高野朋子)mutagenesisには様々な方法がある。polymeraseのmisincorporationの問題もある。mutagenesisについて述べる。2.1を使用するもので基本的にはキットに添付されたプロトコールにしたがって行えば高率にmutantが得られる。mutagenesisが終わった後、再び適当なvectorに入れ直す必要がある。Catalog#K1600-1。このKitは、筆者も使用経験がないので詳しくは、石井功さんに聞いて下さい)。mutagenesisのためのoligomerは1塩基のmutagenesisなら20Merで十分である。両側に5-6Merの糊代をつければ、一つのoligomerで4塩基までのmutagenesisなら難なくうまくいく。無い事が絶対に必要である。一回のmutagenesisで最高3つのoligomerを同時にかえる事ができたが、確立はだいぶ悪い(1/8)。2カ所なら同時にかえられる可能性が高い(1/4)。mutagenesisの成否はsequenceで確認するしかないが、oligomerの中に特定の制限酵素サイトを入れたり潰したりしておくとscreeningが非常に楽である。時にoligomerの前後で予期せぬ変な挿入や欠失が起こっている事があるので、sequenceは必ず行わなければならない。基本的にはキットに添付されているプロトコールに従って行う。注意すべき点のみ指摘する。DNAは、失敗したときの為にも十分量とっておいた方がよい。とっておいた法がよい。5'-phosphrylationがうまく行くかどうかどうかが全体の決め手である。acetate沈澱の操作はまず必要ない。checkを行えば、mutagenesisがうまくいっているクローンを能率良く選んでsequenceする事ができる。後は非常に良くできたキットなので、プロトコールに忠実に従って行う。Catalog#K1600-1(横溝岳彦)前出のkitを用いた際のsubcloningの手間がいらないため、最近は良く用いられている。strandのままでmutagenesisが行える事が一番の利点である。原理的には、自分が変えたい部分のoligonucleotideと、selectionのためのoligonucleotideを同時にannealingさせて、変位鎖を合成し、ミスマッチリペアができないmutantであるmut-Sなるstrainの大腸菌をtransformする。制限酵素siteだけが変わっているplasmidもとれるので、sequenceは不可欠である。Tipsとしては、annealさせるoligoの純度が大切で、最低でも、HPLC精製が必要である。mut-Sを使った方がいい。自分で作ったcellではうまく行かないことが多い。shock)も効率が悪い。