ユニバーサルプライマーによってすべての遺伝子が均一に増幅される。1GeXPで使用するXP-PCRはユニバーサルと遺伝子特異的な配列を持ったキメラプライマーを使い、複数の遺伝子を1つのPCR反応として反応を行う。この方法は従来のマルチプレックスPCRとは異なり、すべての遺伝子産物を均一に増幅することができ、それぞれのPCR産物の相対的な量を維持することができる。2マルチプレックスXP-PCR産物の泳動結果。すべてのターゲット遺伝子のmRNAを含むトータルRNAをテンプレートとした。反応コントロールであるカナマイシン耐性遺伝子(KanR)も同時に増幅している。μg/mL)(PMA/PHA)の組み合わせで刺激した。刺激開始0、3、6、18、24、48時間後に細胞を回収し、-80°Cで保存した。MPLシステムで定量を行った。FXワークステーションを使用した。Profilerソフトウエアに目的の遺伝子配列をダウンロードし入力した後、専用のプライマーデザインソフトを用いてのマルチプレックス用のキメラプライマーを設計した。CA)を使用し、キット付属のプロトコルに従って調製を行った。ngを逆転写反応(RT)に使用した。nMの間で適切な濃度に調整された。MA)で、GeXPスタートキットで推奨されている反応サイクルに従い行われた。1分)×35サイクル;<データ解析>PCR産物は希釈され、キャピラリー電気泳動でサイズによって分離された。フラグメントデータの結果はGenomeLabGeXPソフト(Ver.10、アルゴリズムVer.2.2.1)を用いて解析を行った。すべての遺伝子はβアクチンに対しノーマライズを行った。ノーマライズにはピークエリアの値を用いた。Workstation.分子生物学会年会(カナダ、モントリオール)におけるポスター発表。3マイトジェン刺激に対する遺伝子発現レベル(棒グラフ)とタンパク量データ(線グラフ)。LPS刺激サンプルはオレンジ、PMA/PHA刺激サンプルは青で示した。X軸は刺激時間を示し、Y軸は遺伝子発現量(左側)とサイトカインタンパク量(pg/mL、右側)を示している。LPS刺激後18時間のサンプルは取得していない。各サイトカインにより表示スケールは異なる。Th1/Th2サイトカインキットで複数のサイトカインタンパク量の変化を定量できることが示唆された。今回得られた発現量とタンパク量のデータに概ね良好な相関が見られた。発現量の増加はそれぞれの遺伝子産物であるサイトカインタンパク量の増加と同時もしくはそれに先立って観察された。IL-4はタンパク量が十分でなかったため定量不可能であったが、他のサイトカインはRNA発現レベルとタンパク質量はPMA/PHAの刺激により増加した。PMA/PHA刺激においてRNA発現レベルは刺激後6時間にピークに達したあと減少したが、タンパク量はそれ以降でピークに達し、タンパク量はその後も維持された。IFNγ、TNFα、TNFβ、IL-8、IL-2はPMA/PHAによって強く発現誘導された。IL-2を除くすべてサイトカインの発現レベルはLPS刺激によって上昇したが、IL-2、TNFβ、IFNγのタンパク量はほとんど検出されなかった。LPS刺激によるRNA発現のピークは刺激後約3時間で、PMA/PHA刺激よりも早く起こった。サイトカインタンパク量の増加はRNA発現亢進と同時か、それに少し遅れて観察された。IL-6、IL-8、TNFα、IL-10はLPSによって大きく誘導された。Conclusion10のTh1/Th2サイトカイン遺伝子と3つのコントロール遺伝子をターゲットとしたマルチプレックス遺伝子発現定量システムが、GeXPを使用して構築された。この実験系において、GeXPはLPSやPMA/PHAで刺激されたヒト末梢血単核球でのサイトカイン遺伝子の発現量の変化を測定する有用であることが示唆された。細胞培養上清はヒトTh1/Th2サイトカインキットでサイトカインタンパク量を定量した。500は強力な解析ツールになることが示唆された。GDPRReport。