濾液を、真空中で濃縮し、残渣を、酢酸エチル中でスラリー化した。スラリーを、始めの濾過と同じフィルター上で濾過した。集められた固体を、少量の酢酸エチルで洗浄し、次いで、窒素流下で乾燥すると、白色の固体として7−クロロ−2−オキソ−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾール−5−カルボン酸メチル(93mg、82%)が得られた。H).【0084】7−クロロ−2−オキソ−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾール−5−カルボン酸メチル(351mg、1.55mmol)、1M水酸化リチウム水溶液(0.774mL、1.55mmol)およびテトラヒドロフラン(5mL)を混ぜ合わせ、2時間にわたって50°Cまで加熱した。反応物に、1M水酸化リチウム水溶液(0.774mL、1.55mmol)およびメタノール(10mL)を加え、反応物を、6時間にわたって還流状態まで加熱し、次いで、終夜周囲温度まで冷却した。反応溶液を、真空中で濃縮し、テトラヒドロフランおよびメタノールを除去した。残留水層を、酢酸エチル(2mL)で抽出した。水層に、水(2mL)酢酸エチル(2mL)および3M塩酸水溶液を加えた。混合物を濾過し、固体を、水および酢酸エチルで洗浄した。固体を、窒素流下で乾燥すると、表題化合物(296mg、90%)が得られた。【化8】2.5〜5mLのマイクロ波管に、脱気した1,4ジオキサン(1.5mL)に懸濁した6−ブロモ−4−フルオロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾール(160mg、0.744mmol)を加えた。これに、脱気した水(2mL)に溶かした炭酸ナトリウム(237mg、2.23mmol)と一緒に、トランス−ジ(u−アセタト)ビス[o−(ジ−o−トリルホスフィノ)ベンジル]ジ−パラジウム(II)(26mg、0.043mmol)およびモリブデンヘキサカルボニル(100mg、0.38mmol)を加えた。混合物を、20秒にわたって撹拌し、次いで、10分にわたってマイクロ波中で155°Cにて加熱し、16バール未満に圧力を保った。容器を、取り扱う前にベントし、室温にて終夜放置した。水(2mL)および酢酸エチル(3mL)を、反応物に加え、次いで、混合物を、Celite(登録商標)に通して濾過した。濾液を、酢酸エチルで分配し、分離した。水性画分を、もう一度酢酸エチルで洗浄し、合わせた有機層を取っておいた。HClで酸性化し、褐色の沈殿物を形成させた。混合物を、1時間にわたって4°Cにて冷蔵庫中に放置した。混合物を濾過し、水で洗浄すると、灰色の固体として4−フルオロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾール−6−カルボン酸が得られた、(63%収率)。【化9】トルエン(1000mL)中の(E)−3−(3−ブロモフェニル)アクリル酸(100g、0.44mol)とトリエチルアミン(0.48mol)の混合物に、0〜10°Cにてアジ化ジフェニルホスホリル(127.4g、0.45mol)を滴下添加した。混合物を、終夜室温にて撹拌した。薄層クロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル=8:1)は、反応の終了を示した。得られた混合物を、1N水酸化ナトリウム(500mL)で洗浄し、酢酸エチル(2000mL×3)で抽出した。有機層を濃縮すると、粗製の(E)−1−アジド−3−(3−ブロモフェニル)プロパ−2−エン−1−オンが得られ、次のステップで直接使用した。粗製の(E)−1−アジド−3−(3−ブロモフェニル)プロパ−2−エン−1−オン(粗製約120g)とトルエン(200mL)の混合物を、2時間にわたって還流した。薄層クロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル=8:1)は、出発材料の大部分が消費されたことを示した。混合物を濃縮すると、粗製の(E)−1−ブロモ−3−(2−イソシアナトビニル)ベンゼン(100g、94%)が得られ、次のステップで直接使用した。【0090】トルエン(200mL)中の(E)−1−ブロモ−3−(2−イソシアナトビニル)ベンゼン(100g、0.44mol)の溶液に、190°Cにてトリブチルアミン(100mL)とオキシジベンゼン(500mL)の混合物を滴下添加した。添加後、混合物を、さらに2時間にわたって210°Cにて加熱した。薄層クロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル=1:1)は、反応が終了したことを示した。混合物を、室温まで冷却し、濾過し、固体を、酢酸エチル(50mL×3)で洗浄した。固体を、真空下で乾燥すると、薄黄色の固体として粗製の6−ブロモイソキノリン−1(2H)−オン(30g、30%)が得られ、次のステップで直接使用した。【0091】メタン(300mL)中の6−ブロモイソキノリン−1(2H)−オン(30g、134mmol)、トリエチルアミン(17.6g、174mmol)、塩化パラジウム(II)(0.24g、1.34mmol)および(S)−(−)−2,2’−ビス(ジフェニルホスフィノ)−1,1’−ビナフチル(0.84g、1.34mmol)の混合物を、2MPaの一酸化炭素下で100°Cにて加熱し、12時間にわたって撹拌した。薄層クロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル=1:1)は、反応が終了したことを示した。反応混合物を濃縮し、残渣を、水で洗浄し、固体を濾過し、真空中で乾燥すると、黄色の固体として粗製の1−オキソ−1,2−ジヒドロイソキノリン−6−カルボン酸メチル(23.8g、95%)が得られ、次のステップで直接使用した。【0092】1−オキソ−1,2−ジヒドロイソキノリン−6−カルボン酸メチル(25g、0.133mol)、テトラヒドロフラン(200mL)および水(200mL)の混合物に、室温にて水酸化リチウム(16.8g、0.40mol)を加え、混合物を、4時間にわたって撹拌した。薄層クロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル=1:1)は、反応が終了したことを示した。反応混合物を、酢酸エチル(100mL×3)で抽出し、不純物を除去した。水層を、pH5まで4NHCl水溶液で酸性化し、濾過した。固体を、真空中で乾燥すると、薄黄色の固体として1−オキソ−1,2−ジヒドロイソキノリン−6−カルボン酸(11.3g、48%)が得られた。【化10】1−オキソ−1,2−ジヒドロイソキノリン−7−カルボン酸は、1−オキソ−1,2−ジヒドロイソキノリン−6−カルボン酸、(酸調製4)と類似した方法で調製した。【化11】5−ブロモピコリノニトリル(2.0g、10.9mmol)、イミダゾール(818mg、12mmol)炭酸カリウム(1.66g、12mmol)およびジメチルホルムアミド(40mL)を混ぜ合わせ、20時間にわたって130°Cまで加熱した。反応溶液を蒸発させ、残渣を、ジクロロメタン(150mL)と水(100mL)の間で分配した。相を分離し、有機相を、水(50mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させると、残渣が得られ、ジクロロメタン中2〜3%メタノールグラジエントで溶離するフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、5−(1H−イミダゾール−1−イル)ピコリノニトリル(1.23g、66%)が得られた。【0097】5−(1H−イミダゾール−1−イル)ピコリノニトリル(136mg、0.80mmol)を、2時間にわたって6N塩酸水溶液(10mL)中で還流状態まで加熱した。Biorad)上で精製すると、白色の固体として表題化合物(128mg、84%)が得られた。【化12】クロロホルム(50mL)中の4−アミノ−3−クロロ−5−メチル−ベンゾニトリル(3.0g、18.0mmol)の混合物に、無水酢酸(3.92mL、41.4mmol)を加えた。混合物を、5時間にわたって還流状態にて加熱し、次いで、室温まで冷却した。混合物に、酢酸カリウム(530mg、5.4mmol)および亜硝酸イソアミル(5.28mL、39.6mmol)を加えた。反応物を、16時間にわたって還流状態にて加熱した。反応混合物を、室温まで冷却し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で抽出し、有機物を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中で濃縮すると、褐色の油が得られた。油を、メタノール(25mL)に溶かし、濃塩酸(25mL)を加えた。反応物を、22時間にわたって室温にて撹拌し、メタノールを、真空中で濃縮した。H).【0100】エタノール(52.5mL)中の7−クロロ−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(1.36g、7.66mmol)の混合物に、水(17.5mL)および水酸化カリウム(6.44g、115mmol)を加えた。反応混合物を、16時間にわたって還流状態にて加熱した。【化13】マロン酸ジエチル(151g、0.944mol)を、乾燥テトラヒドロフラン(1L)中の鉱油中60%水素化ナトリウム(37.8g、0.944mol)に撹拌下で滴下添加した。水素発生が止まった後、2−クロロ−5−ニトロピリジン(125g、0.787mol)を加えた。反応混合物を、2時間にわたって還流し、次いで、テトラヒドロフランを、真空中で蒸発させると、粗製の(5−ニトロピリジン−2−イル)マロン酸ジエチルが得られ、精製することなく次の段階で使用した。粗製の(5−ニトロピリジン−2−イル)マロン酸ジエチルを、撹拌下で沸騰している65%硝酸(1.5L)に加えた。反応混合物を、15時間にわたって撹拌下で還流した。反応混合物を、真空中で濃縮し、得られた固体を、クロロホルムで洗浄すると、5−ニトロピリジン−2−カルボン酸(収率65%、85.9g)が得られた。【0104】5−ニトロピリジン−2−カルボン酸(100g、0.60mol)を、5時間にわたってメタノール(1L)および硫酸(57mL)中で還流状態にて加熱した。反応混合物を冷却し、真空中で半分の体積まで減らし、残渣を、炭酸ナトリウムの溶液で中和した。得られた沈殿物を濾過すると、5−ニトロピリジン−2−カルボン酸メチル(収率89%、98g)が得られた。【0105】5−ニトロピリジン−2−カルボン酸メチル(182g、1mol)を、1時間にわたってピペリジン(250mL)中で還流した。反応混合物を、真空中で濃縮すると、粗製の5−ニトロ−2−(ピペリジン−1−イルカルボニル)ピリジンが得られ、さらに精製することなく次の段階のために使用した。粗製の5−ニトロ−2−(ピペリジン−1−イルカルボニル)ピリジンを、酢酸(500mL)中で炭素上10%パラジウム(4g)の存在下に大気圧下で水素により還元した。触媒を、濾過により分離し、溶媒を、真空中で蒸発させると、粗製の6−(ピペリジン−1−イルカルボニル)ピリジン−3−アミンが得られ、さらに精製することなく次の段階のために使用した。濃塩酸(1.5L)中の亜硝酸ナトリウム(69g)の溶液を、0°Cにて粗製の6−(ピペリジン−1−イルカルボニル)ピリジン−3−アミンに加え、混合物を、10分にわたって撹拌した。尿素(20g)を加え、混合物を、15分にわたって撹拌した。ヨウ化ナトリウム(150g)を加え、生成物を、濾過により分離し、エタノールから再結晶すると、5−ヨード−2−(ピペリジン−1−イルカルボニル)ピリジン(5−ニトロピリジン−2−カルボン酸メチルについて計算して収率23%、71g)が得られた。【0108】トルエン(400mL)中の5−ヨード−2−(ピペリジン−1−イルカルボニル)ピリジン(71g、0.23mol)、酢酸パラジウム(II)(1.03g、46mmol)、2−(ジ−tert−ブチルホスフィノ)ビフェニル(2.76g、92mmol)、モルホリン(23.7g、0.28mol)、およびナトリウムtert−ブトキシド(27.8g、0.28mol)を、2時間にわたって95°Cにてアルゴン下で撹拌した。生成物を、クロマトグラフィー(シリカゲル、酢酸エチル)により単離し、エタノールから再結晶すると、4−[6−(ピペリジン−1−イルカルボニル)ピリジン−3−イル]モルホリン(収率37%、22g)が得られた。KOH(100mL)を、4−[6−(ピペリジン−1−イルカルボニル)ピリジン−3−イル]モルホリン(18.3g)に加え、混合物を還流し、次いで、HClで中和した。溶液を、真空中で蒸発させ、生成物を、温イソプロパノールで抽出すると、表題化合物(収率71%、11.5g)が得られた。【化14】2N塩酸(8mL)を、エタノール(20mL)中の3,4−ジアミノ−5−クロロ安息香酸メチル(酸調製1から、435mg、2.17mmol)の溶液に加える。混合物を、還流状態まで加熱し、次いで、アセチルアセトン(437mg、4.37mmol)を、黄色の溶液に加える。黄色の溶液は、添加により紫色に変わった。1時間にわたって還流状態にて撹拌すると、溶液は、黄色に戻った。1時間にわたって還流状態にて撹拌する。溶媒を濃縮し、無色の残渣とする。水(20mL)を加える。懸濁液を、酢酸(20mL)で抽出する。水層を、pH約10まで2N水酸化ナトリウム(約8mL)で塩基性化する。酢酸エチル(3×15mL)で抽出する。塩基性抽出の合わせた有機物を、塩水(5mL)で洗浄する。硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、高真空下で乾燥すると、無色の固体として7−クロロ−2−メチル−1H−ベンゾ[d]イミダゾール−5−カルボン酸メチル(290mg、59%)が得られる。H).【0112】2N水酸化ナトリウム(5mL、5mmol)を、メタノール(7.5mL)中の7−クロロ−2−メチル−1H−ベンゾ[d]イミダゾール−5−カルボン酸メチル(280mg、1.25mmol)の溶液に加える。16時間にわたって65°Cにて撹拌する。メタノールを、真空中で濃縮し、残った水層を、酢酸エチル(10mL)で抽出した。水層を、1N塩酸(約5mL)でpH約4まで酸性化する。無色の沈殿物を濾過し、高真空下で乾燥すると、表題化合物(189mg、72%)が得られた。丸底フラスコに、5−ブロモ−3−フルオロベンゼン−1,2−ジアミン(400mg、2mmol)およびエタノール30mLを充填した。5N塩酸(8mL、40mmol)を加えた。この混合物を、還流状態まで加熱し、2,4−ペンタンジオンを加えた。反応混合物は、深い紫色に変わり、次いで、黄褐色にゆっくりと戻った。反応を、3時間にわたって進行させ、次いで、冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で中和した。反応混合物を、ジクロロメタンで3回抽出した。合わせた有機層を、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。粗製の混合物を、ジエチルエーテル中でトリチュレートし、次いで、濾過すると、黄褐色の固体として6−ブロモ−4−フルオロ−2−メチル−1H−ベンゾ[d]イミダゾール(375mg、82%)が得られた。H).【0115】5mLのマイクロ波バイアルに、脱気したジオキサン(2mL)に懸濁した6−ブロモ−4−フルオロ−2−メチル−1H−ベンゾ[d]イミダゾール(187mg、0.815mmol)、トランス−ジ−μ−アセタトビス[2−(ジ−O−トリルホスフィノ)ベンジル]ジパラジウム(II)(28mg、0.048mmol)およびモリブデンヘキサカルボニル(110mg、0.417ミリモル)を充填した。脱気した10%炭酸ナトリウム水溶液(2.45mL、2.45mmol)を加えた。反応物を、20秒にわたって撹拌した後、10分にわたって極めて高い吸収で155°Cにてマイクロ波中で反応させた。容器をベントし、室温にて終夜放置した。水(2mL)および酢酸エチル(3mL)を加え、混合物を、Celite(登録商標)に通して濾過した。層を分離し、水層を、酢酸エチル(2×)で洗浄した。合わせた酢酸エチル層を取っておいた。水(5mL)を、水層に加え、次いで、3のpHまで0.5M塩酸で酸性化し、次いで、4°Cまで冷却した。固体が形成し、濾過し、水で洗浄すると、黄色の固体として表題化合物(61mg、37%)が得られた。第二クロップが形成し、次いで、濾過すると、表題化合物(100mg、63%)が得られた。【化16】ジメチルホルムアミド(75mL)中の水素化ナトリウム(5.08g、127mmol)の懸濁液に、0°Cにてマロン酸ジエチル(19.26mL、127mmol)を加えた。溶液を、30分にわたって周囲温度にて撹拌し、ジメチルホルムアミド(75mL)中の5−ブロモ−2−クロロ−3−ニトロピリジン(30g、127mmol)の溶液を滴下添加した。暗褐色の混合物を、2時間にわたって100°Cにて撹拌した後、周囲温度まで冷却し、0°Cにて塩化アンモニウムの飽和溶液(500mL)でクエンチした。混合物を、酢酸エチル(3×500mL)で抽出し、合わせた有機物を、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を、真空中で除去すると、暗褐色の油が得られ、フラッシュカラムクロマトグラフィー(10%酢酸エチル/ヘキサン)により精製すると、褐色の固体として2−(5−ブロモ−3−ニトロピリジン−2−イル)マロン酸ジエチル(31.8g、88mmol、69%)が得られた。塩酸水溶液(6M、1.4L)中の2−(5−ブロモ−3−ニトロピリジン−2−イル)マロン酸ジエチル(31.8g、88mmol)の混合物を、18時間にわたって還流状態にて撹拌した。反応混合物を、周囲温度まで冷却し、0°Cにて重炭酸ナトリウム水溶液の飽和水溶液(4L)に極めてゆっくりと加えた。混合物を、ジクロロメタン(7L)で抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を、真空中で除去すると、オレンジ色の油として5−ブロモ−2−メチル−3−ニトロピリジン(13.8g、63.9mmol、72%)が得られ、放置すると固化した。工業用メタノール変性アルコール(330mL)中の5−ブロモ−2−メチル−3−ニトロピリジン(13.8g、63.9mmol)の溶液に、鉄粉(20g)(クランピングを避けるために少量ずつ)と、続いて、濃塩酸水溶液(5mL)を加えた。暗褐色の混合物を、2時間にわたって還流状態にて激しく撹拌し、次いで、冷却し、Celite(登録商標)に通して濾過した(工業用メタノール変性アルコール1Lで洗浄した)。溶媒を、真空中で除去し、残渣を、酢酸エチル(200mL)に取り、重炭酸ナトリウムの飽和水溶液(200mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を、真空中で除去すると、オレンジ色の固体として5−ブロモ−2−メチルピリジン−3−アミン(10.7g、57.5mmol、89.9%)が得られた。3H).【0120】ジクロロメタン(575mL)中の5−ブロモ−2−メチルピリジン−3−アミン(10.7g、57.5mmol)の溶液に、0°Cにて無水酢酸(12mL、126.5mmol)と、続いて、トリエチルアミン(22mL、158mmol)を加えた。混合物を、周囲温度まで温め、18時間にわたって撹拌し、その時点でさらなる当量の無水酢酸(6mL、63mmol)を加えた。混合物を、さらに72時間にわたって周囲温度にて撹拌した。反応混合物を、重炭酸ナトリウムの飽和水溶液(500mL)でクエンチし、有機相を、飽和塩化ナトリウム水溶液(500mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空中で濃縮すると、褐色の固体が得られた。この固体を、ヘキサン中30%酢酸エチルと共にトリチュレートすると、灰色がかった白色固体としてN−(5−ブロモ−2−メチルピリジン−3−イル)アセトアミド(8.28g、36mmol、63%)が得られた。3H).【0121】クロロホルム(550mL)中のN−(5−ブロモ−2−メチルピリジン−3−イル)アセトアミド(8.28g、36mmol)の溶液に、周囲温度にて、酢酸カリウム(4.32g、43.6mmol)、酢酸(2.5mL、43.6mmol)と、続いて、無水酢酸(6.86mL、72.6mmol)を加えた。混合物を、15分にわたって周囲温度にて撹拌した後、40°Cまで加熱した。亜硝酸イソアミルを滴下添加した。反応物を、48時間にわたって60°Cにて撹拌した。反応混合物を、0°Cにて重炭酸ナトリウムの飽和溶液(500mL)中にゆっくりと注いだ。有機相を残しておき、水相を、ジクロロメタン(500mL)で抽出した。合わせた有機物を濃縮し、褐色の油とし、メタノール(500mL)に溶かした。水酸化ナトリウム水溶液(2M、500mL)を、0°Cにて加え、混合物を、1時間にわたって周囲温度にて撹拌した後、メタノールを、真空中で除去した。水性混合物を、酢酸エチル(3×500mL)で抽出した。合わせた有機物を、硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を、真空中で除去すると、淡褐色の固体として6−ブロモ−1H−ピラゾロ[4,3−b]ピリジン(5.5g、27.9mmol、77%)が得られた。1H).【0122】メタノール(125mL)およびアセトニトリル(75mL)中の6−ブロモ−1H−ピラゾロ[4,3−b]ピリジン(5.5g、27.9mmol)の溶液に、トリエチルアミン(22mL、156mmol)、2,2’−ビス(ジフェニルホスフィノ)−1,1’−ビナフチル(1.98g、3.07mmol)、二塩化パラジウム(1.23g、6.98mmol)を加えた。混合物を、20バールの一酸化炭素下に置き、100°Cまで加熱し、18時間にわたって激しく撹拌した。反応混合物を、周囲温度まで冷却し、Celite(登録商標)に通して濾過した後、溶媒を、真空中で除去すると、褐色の油が得られた。この粗製の油を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(1:1、酢酸エチル:ヘキサン)により精製すると、黄白色の固体として1H−ピラゾロ[4,3−b]ピリジン−6−カルボン酸メチル(4.52g、92%収率)が得られた。3H).【0123】メタノール(250mL)および水(190mL)中の1H−ピラゾロ[4,3−b]ピリジン−6−カルボン酸メチル(3.52g、20mmol)の溶液に、0°Cにて、水酸化ナトリウム水溶液(2M、64mL、128mmol)を滴下添加した。懸濁液を、周囲温度まで温め、18時間にわたって撹拌した。メタノールを、真空中で除去し、水性混合物を、酢酸エチル(250mL)で抽出した後、塩酸水溶液(2M、70mL)で酸性化(pH5〜6まで)した。沈殿したクリーム色の固体を濾別し、デシケーター中で乾燥すると、表題化合物(0.675g、4.16mmol、21%収率)が得られた。酢酸(450mL)中の(2−ニトロフェニル)−アセトニトリル(30g、185mmol)および炭素上10%パラジウム(2g)の懸濁液を、2時間にわたって周囲温度にて30psi圧力下にParr装置中で水素化した。混合物を、Celite(登録商標)パッドに通して濾過し、濾液を、真空中で濃縮した。得られた残渣を、酢酸エチル(250mL)に溶かした。得られた溶液を、水(2×100mL)および飽和塩化ナトリウム(50mL)で洗浄し、次いで、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中で濃縮すると、生成物が得られた。粗製の材料を、溶離液として石油エーテル中8%酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィー(100〜200メッシュシリカゲル)により精製すると、固体として(2−アミノフェニル)アセトニトリル(13.5g、55%)が得られた。2H).【0126】ジメチルホルムアミド(150mL)中の(2−アミノフェニル)アセトニトリル(13g、98mmol)の冷却した溶液に、0°Cにて、30分にわたってN−ブロモスクシンイミド(19.3g、108mmol)を少量ずつ加え、1時間にわたって0°Cに維持した。混合物を、酢酸エチル(300mL)で希釈し、水(3×100mL)および飽和塩化ナトリウム(50mL)で洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中で濃縮した。得られた粗製の生成物を、溶離液として石油エーテル中10%酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィー(100〜200メッシュシリカゲル)により精製すると、固体として(2−アミノ−5−ブロモフェニル)アセトニトリル(11g、53%)が得られた。濃塩酸(110mL)中の(2−アミノ−5−ブロモフェニル)アセトニトリル(11g、52mmol)の冷却した溶液に、−50°Cにて、水(20mL)中の亜硝酸ナトリウム(3.9g、57mmol)の溶液をゆっくりと加えた。添加後、混合物を、2時間にわたって−50°Cにて撹拌した。混合物を、0°Cにて33%水酸化アンモニウムで中和し、酢酸エチル(3×100mL)で抽出した。合わせた有機層を、飽和塩化ナトリウム(100mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。得られた粗製の生成物を、溶離液として石油エーテル中10%酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィー(100〜200メッシュシリカゲル)により精製すると、固体として5−ブロモ−3−シアノインダゾール(7g、60%)が得られた。1H).【0128】メタノール(100mL)中の5−ブロモ−3−シアノインダゾール(3g、13.51mmol)、二塩化パラジウム1,1’−ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン(1.76g、2.16mmol)、酢酸ナトリウム(3.32g、40.5mmol)、ジメチルホルムアミド(1mL)の懸濁液を脱気し、16時間にわたってオートクレーブ中で80°Cにて一酸化炭素(80psi)下に保った。混合物を、水(50mL)で希釈し、Celite(登録商標)ベッドに通して濾過し、濾液を濃縮した。得られた残渣を、10%クエン酸溶液で酸性化し、酢酸エチル(2×100mL)で抽出した。合わせた有機層を、塩水(50mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。得られた粗製の生成物を、溶離液としてクロロホルム中10%酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィー(100〜200メッシュシリカゲル)により精製すると、固体として3−シアノ−1H−インダゾール−5−カルボン酸メチル(1.8g、68%)が得られた。(s,3H).【0129】エタノール(40mL)中の3−シアノ−1H−インダゾール−5−カルボン酸メチル(2.5g、12mmol)の溶液に、水(15mL)中の水酸化リチウム(1.04g、24.9mmol)の溶液を加え、16時間にわたって周囲温度にて撹拌した。混合物を濃縮し、得られた残渣を、水(25mL)に溶かし、酢酸エチル(20mL)で洗浄した。水層を、10%クエン酸溶液で酸性化し、得られた沈殿物を濾過し、石油エーテル中50%酢酸エチル(2×10mL)で洗浄し、乾燥すると、褐色の固体として表題化合物(1.9g、82%)が得られた。濃硫酸150mL中の2−ブロモ−4−メチルピリジン29.0g(69mmol)の撹拌した溶液に、重クロム酸カリウム67.9g(231mmol)を少量ずつ加えた。反応混合物を、温度が20〜50°Cに留まるように氷浴で冷却した。添加が終了した後、撹拌を、さらに2時間にわたって室温にて続けた。反応混合物を、氷水2L上にゆっくりと注ぎ、混合物を、室温にて1時間にわたって撹拌した。得られた結晶を、濾過により集め、洗浄液が無色になるまで水で洗浄し、真空中で乾燥すると、2−ブロモイソニコチン酸30.0g(88%)が得られた。【0132】ジクロロメタン(500mL)およびメタノール(35g、1.08mol)中の2−ブロモイソニコチン酸(73g、0.361mol)の氷冷した溶液に、少量ずつ1−エチル−3−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]カルボジイミド塩酸塩(67g、0.434mol)を加えた。混合物を、終夜周囲温度にて撹拌した。シリカゲル120gを加え、溶媒を蒸発させた。残渣を、石油エーテル中5%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、白色の固体として2−ブロモイソニコチン酸メチル58g(75%)が得られた。【0133】2−ブロモイソニコチン酸メチル(216g、1mol)、乾燥アセトニトリル(1.7L)、エチニル(トリメチル)シラン(117g、1.2mol)、ジイソプロピルアミン(122g、1.2mol)、およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(36g、0.05mol)を、窒素流で2回パージした十分に乾燥した三つ口フラスコに入れた。反応混合物を、0.5時間にわたって撹拌し、10°Cまで冷却し、ヨウ化銅(19g、0.1mol)を、窒素流下で加えた。20°Cにて、反応混合物は、濃厚かつ黒くなり、発熱が観察され、続いて、沈殿物が形成した。周囲温度にてさらに2時間にわたって撹拌した。沈殿した残渣を、濾過により分離し、ジエチルエーテル(800mL)で2回洗浄した。濾液を、飽和塩化アンモニウム(2×300mL)および塩水(2×300mL)で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥した後、溶媒を蒸発させた。残渣を、ヘキサンと、続いて、石油エーテル中5%酢酸エチルで溶離するシリカゲルカラムを使用して精製すると、2−((トリメチルシリル)エチニル)イソニコチン酸メチル191g(82%)が得られた。濃硫酸(60mL、1.1mol)を、テトラヒドロフラン(600mL)中の2−((トリメチルシリル)エチニル)イソニコチン酸メチル(127g、0.54mol)および酢酸水銀(51.5g、0.16mol)の懸濁液に加えた。懸濁液を、50°Cにて3時間にわたって撹拌し、終夜保った。反応混合物を、ジエチルエーテル(1.5L)で希釈し、硫酸を、飽和重炭酸ナトリウム(150g、1.7mol)で中和した。水銀塩の残渣を、濾過により分離した。エーテル溶液を、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を除去すると、油として2−アセチルイソニコチン酸メチルが得られ、次のステップで直接使用した。【0135】2Lの三つ口フラスコに、2−アセチルイソニコチン酸メチル(160g、0.894mol)、ジメチルホルムアミド−ジメチルアセトアミド(350mL)およびトルエン(350mL)を加えた。混合物を、Dean−Starkトラップで約5時間にわたって還流し、生成されるメタノールを除去した。追加のジメチルホルムアミド−ジメチルアセトアミドおよびトルエンを加え、約800〜900mLの反応体積を保った。液体クロマトグラフィー−質量分析法が、反応が終了したことを示したら、溶媒を除去すると、黒い固体として粗製の(Z)−2−(3−(ジメチルアミノ)アクリロイル)イソニコチン酸メチルが得られた。粗製の固体は、次のステップで直接使用した。【0136】2Lの三つ口フラスコに、(Z)−2−(3−(ジメチルアミノ)アクリロイル)イソニコチン酸メチル(0.894mol)、ヒドラジン水和物(48.8g)、無水エタノール(1L)を加えた。懸濁液を、終夜20°Cにて撹拌した。溶媒を、真空中で除去した。残渣を、濃塩酸(600mL)に取り、2時間にわたって還流状態まで加熱した。混合物を、周囲温度まで冷却した。得られた沈殿物を濾過し、水、エタノールおよびアセトンで洗浄し、乾燥すると、褐色の固体として表題化合物78.6gが得られた。【化19】ヒドロ亜硫酸ナトリウムの水溶液(水80mL中17.4g、100mmol)を、0°Cにて、テトラヒドロフラン(70mL)およびエタノール(30mL)中の3−(メチルアミノ)−4−ニトロベンゼンカルボン酸メチル(855mg、4.75mmol)に加える。オレンジ色の溶液は、添加でオレンジ色の懸濁液に変わった。混合物を、2時間にわたって室温にて撹拌する。オレンジ色の懸濁液は、この時間にかけて黄色の懸濁液に変わった。飽和重炭酸ナトリウム(100mL)を加えると、黄色の懸濁液は、無色に変わった。混合物を、酢酸エチル(2×100mL)で抽出する。合わせた有機物を、塩水(30mL)で洗浄する。硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、高真空下で乾燥すると、黄色の油として4−アミノ−3−(メチルアミノ)安息香酸メチル(586mg、68%)が得られる。得られた油は、10分後に、放置すると結晶化し始めた。H).【0139】カルボニルジイミダゾール(567mg、3.50mmol)を、室温にて、テトラヒドロフラン(20mL)中の4−アミノ−3−(メチルアミノ)安息香酸メチル(586mg、3.19mmol)の溶液に加える。黄色の溶液を、16時間にわたって室温にて撹拌する。カルボニルジイミダゾール(500mg、0.96)を加える。4時間にわたって室温にて撹拌する。酢酸エチル(75mL)を加える。10%クエン酸(5mL)、1N水酸化ナトリウム(5mL)、および塩水(5mL)で洗浄する。有機物を、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、高真空下で乾燥すると、粗製の黄色の固体(690mg、100%)が得られる。この粗製の固体を、酢酸エチル(10mL)と共にトリチュレートする。沈殿物を濾過し、高真空下で乾燥すると、3−メチル−2−オキソ−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾール−5−カルボン酸メチル(422mg、64%)が得られる。H).【0140】1N水酸化ナトリウム(6.1mL、6.1mmol)を、メタノール(10mL)中の3−メチル−2−オキソ−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾール−5−カルボン酸メチル(420mg、2.04mmol)の懸濁液に加える。懸濁液は、1N水酸化ナトリウムの添加で溶液に変わった。16時間にわたって65°Cにて撹拌する。室温まで冷却し、次いで、濃縮し、メタノールを除去する。水層を、酢酸エチル(5mL)で抽出する。水層を、pH約2まで2N塩化水素(3mL)で酸性化する。水層を濃縮し、固体とする。固体を、水(3mL)と共にトリチュレートする。沈殿物を濾過し、高真空下で乾燥すると、淡褐色の固体として表題化合物(234mg、59%)が得られる。【化20】メタノール(100mL)中の4−アミノ−3−ブロモ−5−ニトロ安息香酸メチル(10g、36.3mmol)および塩化スズ(II)(33g、14.5mmol)の懸濁液を、60°Cまで加熱し、4時間にわたって維持した。反応塊を、周囲温度まで冷却し、濃縮すると、残渣が得られ;残渣を、pHが11になるまで飽和重炭酸ナトリウム水溶液を使用して塩基性化し、水層を、ジクロロメタン(3×200mL)で抽出した。合わせた有機層を、飽和塩化ナトリウム水溶液(200mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮すると、灰色がかった白色の固体として3,4−ジアミノ−5−ブロモ安息香酸メチル(5g、58%)が得られた。2H).【0143】ジクロロメタン(6mL)中の3,4−ジアミノ−5−ブロモ安息香酸メチル(1g、4.0mmol)およびトリエチルアミン(0.4g、4.0mmol)の溶液を、0°Cまで冷却した。ジクロロメタン(15mL)中のトリホスゲン(1.2g、4.08mmol)の溶液を、この溶液に加えた。反応混合物を、周囲温度まで温め、18時間にわたって維持した。反応塊を、水(3mL)でクエンチし、酢酸エチル(3×10mL)で抽出した。合わせた有機層を、飽和塩化ナトリウム水溶液(50mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮すると、灰色がかった白色の固体として7−ブロモ−2−オキソ−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾール−5−カルボン酸メチル(500mg、45%)が得られた。3H).【0144】7−ブロモ−2−オキソ−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾール−5−カルボン酸メチル(238mg、0.878mmol)および2N水酸化ナトリウム水溶液(1.50mL、3.0mmol)を、メタノール(5mL)中で混ぜ合わせ、90分にわたって50°Cまで加熱した。反応溶液を濃縮し、メタノールを除去した。反応残渣に、酢酸エチル(5mL)を加えた。得られた溶液を、1N塩酸水溶液(1.5mL)で酸性化し、4の最終pHを得た。沈殿物が形成し、濾過し、真空下で乾燥すると、固体として表題化合物(226mg、100%)が得られた。【化21】アセトニトリル(2mol)、ヒドロキシルアミン塩酸塩(2mol)およびナトリウムメトキシド(2mol)の混合物を、3日にわたって室温にて撹拌し、次いで、濾過し、濾液を、20°C未満で濃縮すると、白色の固体として(Z)−N’−ヒドロキシアセトイミドアミド(150g)が得られ、次のステップで直接使用した。【0147】メタノール(800mL)、水酸化カリウム(44g、0.95mol)およびピリジン−2,4−ジカルボン酸ジメチル(ChemPacific)(156g、0.79mol)の混合物を、0.5時間にわたって還流し、次いで、真空中で蒸発させると、黄色の固体として4−(メトキシカルボニル)ピコリン酸(144g)が得られた。【0148】ジクロロメタン(500mL)中の4−(メトキシカルボニル)ピコリン酸(150g、1.62mol)に、塩化オキサリル(400mL)を加え、3日にわたって25〜30°Cに温度を保った。反応物を、真空中で蒸発させると、黄色の油として2−(クロロカルボニル)イソニコチン酸メチルが得られた。【0149】ジクロロメタン(500mL)中の2−(クロロカルボニル)イソニコチン酸メチルの溶液に、(Z)−N’−ヒドロキシアセトイミドアミドおよびトリエチルアミンを加え、1日にわたって25〜30°Cに温度を保った。反応物を、真空中で濃縮すると、黄色の固体として(Z)−2−((1−アミノエチリデンアミノオキシ)カルボニル)イソニコチン酸メチルが得られた。【0150】トルエン(1L)中の(Z)−2−((1−アミノエチリデンアミノオキシ)カルボニル)イソニコチン酸メチルの溶液を、終夜還流状態にて加熱した。得られた混合物を蒸発させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると、白色の固体として2−(3−メチル−1,2,4−オキサジアゾール−5−イル)イソニコチン酸メチルが得られた。水酸化リチウム(15g、0.35mol)、エタノール(500mL)および2−(3−メチル−1,2,4−オキサジアゾール−5−イル)イソニコチン酸メチル(52g、0.23mol)の混合物を、5時間にわたって室温にて撹拌し、次いで、混合物を、真空中で濃縮した。水を加え、次いで、酢酸エチルで抽出した。水層を、1N塩酸水溶液でpH1.5として、酢酸エチルで抽出した。有機層を、真空中で濃縮すると、白色の固体として表題化合物(42g)が得られた。【化22】メチルビニルケトン(146mL)を、テトラヒドロフラン(18L)中の4−ホルミルピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチル(375g)の溶液に加えた。反応混合物を、−5°Cまで冷却し、エタノール中の水酸化カリウムの溶液(3N、0.243L)を、10分かけて滴下添加した。反応混合物を、室温まで温め、16時間にわたって撹拌した。シクロヘキサン(10L)を加え、溶液を、飽和塩化ナトリウム(3×10L)で洗浄した。有機層を濃縮し、油とした。この油を、80:20シクロヘキサン/酢酸エチル2Lに溶かし、Celite(登録商標)に通して濾過し、不溶の材料を除去した。濾液を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(70:30ヘキサン/酢酸エチル)を介して精製すると、油として生成物が得られた。油を、ヘキサン中でトリチュレートすると、白色の固体として望ましい生成物(131g、28%)が得られた。【化23】Dean−Starkトラップを取り付けた2Lの三つ口フラスコ中で撹拌する4−ホルミルピペリジン−1−カルボン酸ベンジル(90.0g、363.9mmol)のベンゼン(700mL)溶液に、p−トルエンスルホン酸(6.92g、36.4mmol)を加えた。反応物を、70°Cまで加熱し、3−ブテン−2−オン(61.8mL、753mmol)を加え、混合物を、24時間にわたって還流状態にて加熱し、トラップに放出された水を集めた。反応物を、室温まで冷却し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液500mLで洗浄した。有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた暗褐色の油を、ジクロロメタン200mLに取り、シリカパッド(600mLのシリカ)に通して濾過し、ヘプタン2Lと、続いて、50%酢酸エチル/ヘプタン3L、次いで、酢酸エチル3Lで溶離し、1Lずつ画分を集めた。きれいな生成物を含有する画分を合わせ、濃縮すると、濃厚な褐色の油として表題化合物68.1gが得られた。不純な生成物を含有する画分を合わせ、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー(10〜80%酢酸エチル/ヘプタン、340gのシリカゲル)により精製すると、濃厚な褐色の油として表題化合物がさらに23.6g得られた。91.7g(94.1%)の合わせた収量が実現した。【化24】9−オキソ−3−アザスピロ[5.5]ウンデカ−7−エン−3−カルボン酸ベンジル、調製I−1A−1(4.89g、16.3mmol)を、エタノール60mLに溶かし、tert−ブチルヒドラジン塩酸塩(2.44g、19.6mmol)を加えた。混合物を、4時間にわたって還流状態にて加熱し、次いで、48時間にわたって60°Cにて撹拌した。反応物を、室温まで冷却し、減圧下で濃縮すると、黄褐色の油が得られ、放置すると固化し、黄褐色の固体として表題化合物6.60g(99%)が得られた。調製I−1A−1a(8.00g、19.7mmol)を、ジクロロメタン100mLに溶かし、重炭酸ナトリウム(1.7g、19.7mmol)で処理した。30分にわたって撹拌し、形成された塩化ナトリウムを濾別し、減圧下で濃縮すると、(E)−9−(2−tert−ブチルヒドラゾノ)−3−アザスピロ[5.5]ウンデカ−7−エン−3−カルボン酸ベンジルが得られた。250mLの丸底フラスコに、ジメチルホルムアミド80mLを充填し、0°Cまで冷却した。オキシ塩化リン(5.51mL、59.1mmol)を、2分かけて滴下添加し、0°Cにて30分撹拌した。この溶液に、DMF15mL中の(E)−9−(2−tert−ブチルヒドラゾノ)−3−アザスピロ[5.5]ウンデカ−7−エン−3−カルボン酸ベンジルを加え、反応物を、18時間にわたって80°Cにて加熱した。反応物を、室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。得られた油を、酢酸エチル500mLに溶かし、塩水2×150mLで洗浄した。水層を、追加の酢酸エチル100mLで抽出した。合わせた有機層を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた油を、フラッシュクロマトグラフィー(10〜80%酢酸エチル/ヘプタングラジエント、100gのシリカ)により精製すると、黄白色の油として表題化合物4.89g(65%)が得られた。調製I−1A−1b(560mg、1.48mmol)を、20%メタノール/テトラヒドロフラン混合物25mLに溶かした。N−ブロモスクシンイミド(315mg、1.77mmol)を加え、混合物を、30分にわたって撹拌した。混合物を、減圧下で濃縮した。得られた油を、酢酸エチル50mLと水50mLの間で分配した。有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた油を、フラッシュクロマトグラフィー(10〜80%酢酸エチル/ヘプタングラジエント、25gのシリカ)により精製すると、無色の油として表題化合物538mg(73%)が得られた。調製I−1A−1c(150mg、0.31mmol)を、テトラヒドロフラン5mLに溶かし、カリウムtert−ブトキシド(0.61mL、0.61mmol、1Mテトラヒドロフラン)で処理し、30分撹拌した。HCl水溶液(5mL)を加え、混合物を、室温にて15分撹拌した。水50mLで希釈し、酢酸エチル50mLで抽出した。有機層を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー(10gのシリカ、10〜80%酢酸エチル/ヘプタングラジエント)により精製すると、透明な油として表題化合物86mg(71%)が得られた。反応物を、室温にて2時間にわたって撹拌し、次いで、触媒を、濾過により除去した。濾液を、減圧下で濃縮した。混合物を、30分にわたって撹拌し、減圧下で濃縮した。得られた無色の固体を、ヘプタン20mLと共にトリチュレートすると、無色の固体として表題化合物265mg(80%)が得られた。調製I−1A−1d(261mg、0.66mmol)を、テトラヒドロフラン5mLに溶かし、−78°Cまで冷却した。THF)を加え、−78°Cにて30分、次いで、0°Cにて10分撹拌した。混合物を、−78°Cまで冷却し、ヨウ化メチル(0.12mL、1.98mmol)で処理した。混合物を、室温まで温めながら1時間撹拌した。反応物を、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLでクエンチした。混合物を、水50mLで希釈し、酢酸エチル100mLで抽出した。有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。110mg(41%)が得られた。調製I−1A−1dと調製I−1A−4aの1:1混合物からなる追加の材料(60mg)も単離された。40mg(14%)が得られた。調製I−1A−3bは、調製I−1A−1dの合成と同様に調製した。調製I−1A−4bは、調製I−1A−1dの合成と同様に調製した。調製I−1A−1e(265mg、0.89mmol)および塩化1H−インダゾール−5−カルボニル塩酸塩(212mg、0.98mmol)を、ジクロロメタン10mLに懸濁し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.62mL、3.56mmol)を滴下添加した。混合物を、18時間にわたって周囲温度にて撹拌した。混合物を、ジクロロメタン150mLで希釈し、塩水で洗浄した。有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた油を、メタノール25mLに取り、炭酸カリウム300mgで処理した。混合物を、室温にて30分撹拌した。メタノールを、減圧下で除去し、得られた油を、酢酸エチル100mLと水の間で分配した。有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、次いで、酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、無色の粉末として表題化合物126mg(35%)が得られた。下の表1に列挙されている化合物は、商業的に入手可能である、当業者によく知られている調製物を使用して調製される、または他の中間体について上に記載されている経路に類似した方法で調製される適切な出発材料を使用して、化合物1A−1の合成について上に記載されているものに類似した手順を使用して調製した。下に列挙されている化合物は、当初は遊離塩基として単離され、試験するためにそれらの対応する塩酸塩に変換されることがある。OJ−H(10×250);移動相:85:15(CO2/メタノール);流速=10mL/分]を使用して分離し、対応する2つのエナンチオマーを得た。Ent1:保持時間=4.29分;Ent2:保持時間=5.88分。薬理学的データ生物学的プロトコル動物、特に、哺乳動物(例えば、ヒト)における疾患(本明細書に詳述されているものなど)の治療における本発明の化合物の有用性は、下に記載されているインビトロアッセイおよびインビボアッセイを包含する当業者に知られている従来のアッセイにおけるその活性により証明することができる。そのようなアッセイは、本発明の化合物の活性を、他の知られている化合物の活性と比較することができる手段も提供する。本発明の化合物のACC阻害活性を、標準的手順に基づく方法により証明した。式(I)の化合物についてのACC活性の直接阻害は、組換えヒトACC1(rhACC1)および組換えヒトACC2(rhACC2)の調製物を使用して決定した。アッセイにおいて使用することができる組換えヒトACC1およびACC2の代表的な配列は、それぞれ図1(配列番号1)および図2(配列番号2)に提供される。【0181】[1]rhACC1の調製。Diagnostics;Mannheim、Germany)に懸濁した。細胞を、3サイクルの凍結融解により溶解し、40分にわたって40,000×gにて遠心分離した(4°C)。Healthcare;Piscataway、NJ)上に直接ロードし、20カラム体積(CV)にわたって最高で0.5Mまでのイミダゾールグラジエントで溶離した。Healthcare)カラム上に直接ロードし、20CVにわたって最高で1MまでのNaClグラジエントで溶離した。Diagnostics)、ホスファターゼを阻害した。アリコートを調製し、−80°Cにて凍結させた。【0182】[2]rhACC1阻害の測定。#3676(Costar、Cambridge、MA)384ウェルプレート中でアッセイした。典型的には、10μl反応を、25°Cにて120分にわたって実行し、Transcreenerの停止および検出緩衝液10μlを添加し、組合せを、さらに1時間にわたって室温にてインキュベートした。Fluorescenceリーダー(Perkinelmer)で取得した。【0183】[3]rhACC2の調製。ヒトACC2阻害を、精製した組換えヒトACC2(hrACC2)を使用して測定した。TO−TOPO(Invitrogen、Carlsbad、CA)中にサブクローニングした。5リットルに収集した。Avidinカラム(Promega、Madison、Wisconsin)に適用し、5mMビオチンで溶離した。4mgが、0.05mg/mLの濃度(A280により決定した)にて95%の推定純度(A280により決定した)で溶離された。EDTA、および5%グリセロール中で透析した。プールタンパク質を、融解時の活性の損失なしに−80°Cにて凍結させ、保存した。ACC2活性の測定およびACC2阻害の評価については、試験化合物をDMSOに溶かし、最終DMSO濃度が1%の5×ストックとしてrhACC2酵素に添加した。【0184】[4]ヒトACC2阻害の測定。#3676(Costar、Cambridge、MA)384ウェルプレート中でアッセイした。典型的には、10μl反応を、25°Cにて50分にわたって実行し、Transcreenerの停止および検出緩衝液10μlを添加し、組合せを、さらに1時間にわたって室温にてインキュベートした。Fluorescenceリーダー(Perkinelmer)で取得した。Transcreenerアッセイを使用した結果を、上の実施例に例示されている式(I)の化合物について下の表に要約している。本発明の化合物のACC阻害活性は、処置動物の肝臓および筋肉組織においてマロニル−CoAレベルを低減するそれらの能力の評価によりインビボで確認することができる。実験動物におけるマロニル−CoA産生阻害の測定。この方法において、自由摂取の標準固形飼料および水で飼養されている雄性Sprague−Dawleyラット(225〜275g)を、研究の前に無作為化した。動物に、摂食させるかまたは実験開始の前の18時間にわたって絶食させた。明期に入って2時間で、動物に、5mL/kgの体積(0.5%メチルセルロース;ビヒクル)または適切な化合物(ビヒクル中で調製した)を経口投与した。摂食ビヒクル対照は、ベースラインの組織マロニル−CoAレベルを決定するために包含し、一方、絶食動物は、マロニル−CoAレベルに対する絶食の影響を決定するために包含した。化合物投与の1時間後、動物を、CO2で窒息させ、組織を摘出した。Microtainer管に入れ、混合し、氷上に置いた。血漿を使用し、薬物曝露を決定した。肝臓および大腿四頭筋を摘出し、直ちに凍結クランプし、ホイルに包み、液体窒素中で保存した。組織を、液体N2下で粉砕し、サンプリングにおける均一性を確保した。Biomedicals、PN6910)中の5体積の10%トリカルボン酸で組織(150〜200mg)から抽出した。Centrifuge5402)後に細胞残屑から取り出した。試料を、分析が終了するまで−80°Cにて安定に凍結させた。肝臓および筋肉組織中のマロニルCoAレベルの分析は、下記の方法論を使用して評価することができる。方法は、下記の材料を利用する:Isotec(Miamisburg、OH、USA)から購入したマロニル−CoA四リチウム塩およびマロニル−13C3−CoA三リチウム塩、過塩素酸ナトリウム(Sigma、カタログ番号410241)、トリクロロ酢酸(ACROS、カタログ番号42145)、リン酸(J.T.Baker、カタログ番号0260−01)、ギ酸アンモニウム(Fluka、カタログ番号17843)、メタノール(HPLCグレード、J.T.Baker、カタログ番号9093−33)、および水(HPLCグレード、J.T.Baker、4218−03)を使用し、必要な移動相を作成した。I.D(カタログ番号00M−S033−B0−CB)は、Phenomenex(Torrance、CA、USA)から入手した。Corporation(Milford、MA、USA)から購入した。【0191】この方法は、下記の機器を利用して行うことができる。6ポート2位置弁を使用する二次元クロマトグラフィー。PALオートサンプラーを介して導入した。オートサンプラー用のニードル洗浄液は、Wash1については水中10%トリクロロ酢酸(w/v)であり、Wash2については90:10メタノール:水である。Ovenを使用して35°Cに維持した。二次元クロマトグラフィーは、オンライン固相抽出および逆相クロマトグラフィーのための異なるグラジエント溶離条件を使用して並行して行った。方法の一般的な設計は、一次元を、試料クリーンアップおよび対象とする分析物の捕捉と、続く、一次元から二次元上への溶離のために両次元の短いカップリングのために利用するようになっていた。続いて、次元をアンカップリングし、定量化のための二次元からの分析物のグラジエント溶離を可能にし、同時に、配列の次の試料のために一次元を調製した。両次元が、一緒に短くカップリングされた場合、一次元中の移動相の流れは、二次元上への分析物溶離のために逆転され、最適なピーク幅、ピーク形状、および溶離時間を可能にした。strata−Xオンライン固相抽出カラムならびに溶媒Aについては100mM過塩素酸ナトリウム/0.1%(v/v)リン酸および溶媒Bについてはメタノールからなる移動相を利用した。C18逆相カラムならびに溶媒Aについては100mMギ酸アンモニウムおよび溶媒Bについてはメタノールからなる移動相を利用した。グラジエントの初期条件を、2分にわたって維持し、この間に、分析物を、分析用カラムに移した。初期条件は、分析用で保持している間にオンラインSPEカラムから分析物を溶離するのに十分な強度であることが重要であった。その後、グラジエントは、洗浄および再平衡ステップの前に4.5分で74.5%Aまで直線的に上がった。質量分析は、HPLCとカップリングされた場合、複雑なマトリックス中の分析物を定量的に測定するための高度に選択的かつ高感度な方法であり得るが、依然として妨害および抑制を受ける。二次元HPLCを質量分析計とカップリングすることにより、これらの妨害は、有意に低減された。多重反応モニタリング(MRM)特徴を利用することにより、信号対雑音比は、顕著に改善された。【0196】このアッセイについては、質量分析計を、TurboIonSpray電圧が2250Vの陽イオンモードで操作した。噴霧ガスは、450°Cまで加熱した。デクラスタリング電位(DP)、集束電位(FP)、および衝突エネルギー(CE)は、それぞれ60、340、および42Vに設定した。四重極1(Q1)分解能は、ユニット分解能に設定し、四重極3(Q3)は、低に設定した。CADガスは、8に設定した。853、303〜313)、およびマロニル−13C3−CoAについて:857.1→350.0m/zであった。溶離液を、分析物についての予想溶離時間の近くで質量分析計に方向を変えさせ、そうでなければ、供給源の保持および器具の頑健性の改善に役立てるために廃棄物に方向を変えさせた。Biosystems)を使用して取り込んだ。マロニルCoAの組織濃度を、水中トリクロロ酢酸の10%溶液中で調製した標準曲線から計算した。組織抽出物中のマロニル−CoAを定量化するための標準曲線を含む試料は、10%(w/v)トリクロロ酢酸(TCA)中で調製し、0.01〜1pmol/μLの範囲とした。マロニル−13C3−CoA(0.4pmol/μLの最終濃度)を、各標準曲線成分および試料に内部標準として添加した。【0198】6個のアッセイ内品質対照を調製した;絶食動物から調製されたプール抽出物から3個および摂食動物から作製されたプールから3個。これらを、0、0.1または0.3pmol/μLの12C−マロニル−CoAならびにマロニル−13C3−CoA(0.4pmol/μL)をスパイクした独立した試料として実行した。各アッセイ内品質対照は、内部標準(0.4pmol/μL)および12C−マロニル−CoAが寄与する残りの部分と共に水性組織抽出物の85%を含有した。大腿四頭筋の1つの絶食および1つの摂食プール試料ならびに/または肝臓の1つの絶食および1つの摂食プール試料からなるアッセイ間対照を、各実行において包含させた。すべてのそのような対照に、マロニル−13C3−CoA(0.4pmol/μL)をスパイクする。式(I)【化1】の化合物、または薬学的に許容できるその塩(式中、R1は、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C7)シクロアルキル、テトラヒドロフラニルまたはオキセタニルであり、前記(C1〜C6)アルキルは、(C1〜C3)アルコキシ、ヒドロキシ、フルオロ、フェニル、テトラヒドロフラニルまたはオキセタニルから独立して選択される1〜2個の置換基で置換されていてもよく、R2は、水素、ハロ、(C1〜C3)アルキル、またはシアノであり、R3は、各々独立して、水素または(C1〜C3)アルキルであり、R4は、(C6〜C10)アリール、5〜12員ヘテロアリールまたは8〜12員縮合複素環式アリールであり、前記(C6〜C10)アリール、5〜12員ヘテロアリールまたは8〜12員縮合複素環式アリールは、(C1〜C3)アルキル、(C1〜C3)アルコキシ、ハロ、アミノ、(C1〜C3)アルキルアミノ、ジ(C1〜C3)アルキルアミノ、ヒドロキシ、シアノ、アミド、フェニル、5〜6員ヘテロアリールまたは5〜6員ヘテロシクリルから独立して選択される1〜3個の置換基で各々置換されていてもよい)。【請求項2】R1が、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C7)シクロアルキル、またはテトラヒドロフラニルであり、R2が、水素またはメチルである、請求項1に記載の化合物、または薬学的に許容できるその塩。【請求項3】R1が、エチル、イソプロピルまたはt−ブチルであり、各R3が、水素であり、R4が、フェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、インドリル、ベンゾピラジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾイミダゾロニル、ピロロピリジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリジニル、ピラゾロピリミジニル、インダゾリル、インドリノニル、ナフチリジニル、キノリニル、キノリノニル、ジヒドロキノリノニル、オキソ−ジヒドロキノリノニル、イソキノリニル、イソキノリノニル、ジヒドロイソキノニルまたはオキソ−ジヒドロイソキノニルであり、各々が、フルオロ、クロロ、メチル、メトキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、アミド、シアノ、フェニル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピリジニルまたはモルホリニルから独立して選択される1〜3個の置換基で置換されていてもよい、請求項2に記載の化合物、または薬学的に許容できるその塩。【請求項4】R1が、イソプロピルまたはt−ブチルであり、R2が、水素である、請求項3に記載の化合物、または薬学的に許容できるその塩。【請求項5】R4が、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、1−オキソ−1,2−ジヒドロイソキノリニル、1H−ピロロ[3,2−b]ピリジニル、2−オキソ−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾリル、1H−ピラゾリルフェニル、1H−ピラゾリルピリジニル、または1H−イミダゾリルフェニルであり、各々が、1〜2個のメチル、クロロまたはフルオロで置換されていてもよい、請求項4に記載の化合物、または薬学的に許容できるその塩。【請求項6】2−tert−ブチル−1’−(1H−インダゾール−5−カルボニル)−4,6−ジヒドロスピロ[インダゾール−5,4’−ピペリジン]−7(2H)−オン;2−tert−ブチル−1’−(4−クロロ−3−メチル−フェニルカルボニル)−4,6−ジヒドロスピロ[インダゾール−5,4’−ピペリジン]−7(2H)−オン;2−tert−ブチル−1’−(1H−インダゾール−5−カルボニル)−6,6−ジメチル−4,6−ジヒドロスピロ[インダゾール−5,4’−ピペリジン]−7(2H)−オン;2−tert−ブチル−1’−(1H−インダゾール−5−カルボニル)−6−メチル−4,6−ジヒドロスピロ[インダゾール−5,4’−ピペリジン]−7(2H)−オン;(R)−2−tert−ブチル−1’−(1H−インダゾール−5−カルボニル)−6−メチル−4,6−ジヒドロスピロ[インダゾール−5,4’−ピペリジン]−7(2H)−オン;および(S)−2−tert−ブチル−1’−(1H−インダゾール−5−カルボニル)−6−メチル−4,6−ジヒドロスピロ[インダゾール−5,4’−ピペリジン]−7(2H)−オンからなる群から選択される化合物、または薬学的に許容できるその塩。【請求項7】2−tert−ブチル−1’−(1H−インダゾール−5−カルボニル)−4,6−ジヒドロスピロ[インダゾール−5,4’−ピペリジン]−7(2H)−オン;(R)−2−tert−ブチル−1’−(1H−インダゾール−5−カルボニル)−6−メチル−4,6−ジヒドロスピロ[インダゾール−5,4’−ピペリジン]−7(2H)−オン;および(S)−2−tert−ブチル−1’−(1H−インダゾール−5−カルボニル)−6−メチル−4,6−ジヒドロスピロ[インダゾール−5,4’−ピペリジン]−7(2H)−オンから選択される請求項6に記載の化合物、または薬学的に許容できるその塩。少なくとも1つの追加の抗糖尿病薬をさらに含む、請求項8に記載の組成物。前記抗糖尿病薬が、メトホルミン、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、ダイヤビニーズ、グリベンクラミド、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、グリクラジド、グリペンチド、グリキドン、グリソラミド、トラザミド、トルブタミド、テンダミスタット、トレスタチン、アカルボース、アジポシン、カミグリボース、エミグリテート、ミグリトール、ボグリボース、プラジミシン−Q、サルボスタチン、バラグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、イサグリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン、エキセンジン−3、エキセンジン−4、トロデュスケミン、レセルバトロール、ヒルチオサール抽出物、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチンおよびサクサグリプチンからなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。動物において2型糖尿病および糖尿病関連障害を治療するための方法であって、そのような治療を必要としている動物に、治療有効量の請求項1に記載の化合物または薬学的に許容できるその塩を投与するステップを含む方法。動物において非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)または肝インスリン抵抗性を治療するための方法であって、そのような治療を必要としている動物に、治療有効量の請求項1に記載の化合物または薬学的に許容できるその塩を投与するステップを含む方法。動物において2型糖尿病および糖尿病関連障害を治療するための方法であって、そのような治療を必要としている動物に、請求項8に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。動物において非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)または肝インスリン抵抗性を治療するための方法であって、そのような治療を必要としている動物に、請求項8に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。ekouhou.net。