簡単に混ぜて、冷やすために湿った氷の上に置くために溶液を渦。溶液はホスファターゼ阻害剤から黄色い色調を持ちてもよい。冷凍庫からROIの半球を含む1.5mL遠心マイクロチューブを取り外します。使用する半球が、各実験群の抽出条件間で相殺されていることを確認します。つのサンプルには右半球を使用します。メスを使用して、凍結した脳組織を2mLガラステフロンホモジナイザーに移します。テフロンチューブに500μLのリシスバッファーを追加します。害虫Bを使用して、固体材料の目に見える量が存在しないまで、15ストロークを使用して同じ組織を均質化する。各ストローク中に回転モーション(時計回りまたは反時計回り)を使用します。mLマイクロ遠心管に移します。チューブを湿った氷の上に置き、30分間インキュベートします。gおよび4°Cで10分間スピンします。mLマイクロ遠心管に配置します。°Cで保存することができる細胞質画分です。μLの抽出バッファーを追加し、ピペッティングによって再中断します。ペレットを渦に入れしないでください。再懸濁したペレットを含むチューブを氷の上に置き、30分間インキュベートします。°Cで20分間スピンします。mLマイクロ遠心管に配置します。ペレットを破棄できるようになりました。Dcタンパク質アッセイ(メーカーの指示に従って)、または非イオン性洗剤を使用して収集されたサンプルの同等のアッセイを使用して、細胞質抽出および核抽出のタンパク質濃度を測定します。プロテアソーム活性アッセイ(セクション4)またはウェスタンブロッティング(セクション5)に直ちに進みます。サンプルは必要になるまで-80°Cで貯えることができる。NaClおよび10%SDSを含む一般的なラボ化学物質の事前に作られたストックソリューションを使用します。バッファを準備します。mLの超純物(脱イオン化・蒸留)水をクリーンな100mLビーカーに加えます。μL、プロテアーゼ阻害剤カクテルの100μL、ホスファスターの100μL、スクロースの10.944gを加えます。ショ糖が完全に溶解するまで、攪拌バーと混ぜます。ピペットを使用して溶液に塩酸(HCl)を滴下してpHを~7.4にします。mLの容積フラスコに移します。超純水を加えて100mLにボリュームを取り入れます。必要になるまで氷の上で最終的な溶液を冷やします。均質化バッファーを準備します。mLの超純物(脱イオン化・蒸留)水をクリーンな100mLビーカーに加えます。μL、プロテアーゼ阻害剤カクテルの100μL、ホスファターゼ阻害剤カクテルの100μL、10%SDSの2,000μLを加えます。注:イオン性洗剤は、プロテアソーム複合体の脱線をもたらすことによってプロテアソーム活性アッセイを妨げる可能性がある。必要に応じてプロテアソーム機能を維持するために、SDSの体積を下げることができます。ピペットを使用して溶液にHClをドロップワイズで追加して、pHを~7.4にします。mLの容積フラスコに移します。超純水を加えて100mLにボリュームを取り入れます。最終溶液を室温で保存します。SDSが溶液の外に沈殿するように冷やさらない。冷凍庫からROIの半球を含む1.5mL遠心分離機を取り外します。使用する半球が、各実験群の抽出条件間で相殺されていることを確認します。つのサンプルには右半球を使用します。メスを使用して、凍結した脳組織を2mLガラステフロンホモジナイザーに移します。μLのTEVPバッファを追加します。害虫Bを使用して、固体材料の目に見える転移が存在しないまで、15ストロークを使用して同じ組織を均質化する。各ストローク中に回転モーション(時計回りまたは反時計回り)を使用します。mLマイクロ遠心管に移します。gでサンプルを遠心分離します。mLマイクロ遠心分離管に移します。gでサンプルを遠心分離します。元のペレット(P1)は核および大きい破片を含み、捨てることができる。mLマイクロ遠心管に移します。これは細胞細分画です。ペレット(P2)に50μLの均質化バッファーを追加し、固体材料が見えなくなるまでピペッティングで再中断します。gでサンプルを遠心分離します。mLマイクロ遠心管に上清を移す;これは粗シナプトソーム膜(シナプス)画分です。ペレットは廃棄することができる。Dcタンパク質アッセイ(メーカーの指示に従って)、またはイオン洗剤を使用して収集されたサンプルの同等のアッセイを使用して、シナプス画分のタンパク質濃度を測定します。プロテアソーム活性アッセイ(セクション4)またはウェスタンブロッティング(セクション5)に直ちに進みます。サンプルは必要になるまで-80°Cで貯えることができる。プロテアソーム活性アッセイ注:プロテアソーム活性は、20Sプロテアソーム活性キットのわずかに改変されたバージョンを使用して均質化された脳組織で測定することができる。このアッセイは、完全な26Sプロテアソーム複合体の活性を直接測定するものではありません。20Sコアの活性を測定し、26Sプロテアソーム複合体全体とは対照的に、コア自体の活動を理解するプロキシとしてのみ機能することを意味します。このアッセイの成功は、繰り返し凍結解凍サイクルおよび/または洗剤、特にイオンのレベルを増加させることで減少し、360/460(励起/発光)フィルタセットと37°Cまでの加熱能力を備えたプレートリーダーの使用を必要とします。プレートリーダーの設定:37°Cに事前に暖め、実行を通して保持します。使用する96ウェルプレートが明確な場合は、光学系の位置をボトムに設定します。蛍光読み取りオプションの下で、古いプレートリーダーモデルを自動ゲインに設定します。新しいモデルはこのためにプリセットされています。2時間の時間でキネティックランをプログラムし、30分ごとにスキャン(読み取り)します。mLの超純水でキットに設けられている10倍のアッセイバッファーを再構成します。バッファーに追加します。これはサンプルのプロテアソーム活動を有意に高め、アッセイの信頼性を向上させる。最終的な20Sアッセイバッファーは、必要になるまで氷上または4°Cで保存することができ、数ヶ月間安定しています。μLのキットで提供されるAMC標準を再構成します。標準は光に敏感であるので、暗闇の中または低照度条件下でこのステップを実行します。μLを16、8、6.4、3.2を追加します。これは、均質化されたサンプルにおけるプロテアソーム活性のプレートリーダーの較正および分析に使用される一連の高から低AMC濃度を作成します。必要になるまで、すべての希釈された基準を暗闇の中で氷の上に保管してください。μLのキットで提供されるプロテアソーム基板(Suc-LLVY-AMC)を再構成します。基板は光に敏感なため、暗い環境や低照度条件下でこの手順を実行します。mLマイクロ遠心管でプロテアソーム基板の1:20希釈を作成します。希釈した基板を必要になるまで暗闇の氷の上に保管します。十分な希釈基板が必要になります。所望のサンプルを解凍(凍結した場合)、96ウェルプレートに正規化された量を追加します。各サンプルを重複して実行します。必要なサンプルの量は、組織の調製に基づいて異なります。μgは、任意の細胞分画に対して十分です。サンプルウェル容積を超純水で80μLにします。追加される量は、追加されたサンプルの量によって異なります。