FavoritesSummaryこのプロトコルは、げっ歯類の脳の異なる細胞区画におけるユビキチンプロテアソーム系(UPS)活性を効率的に定量するように設計されている。ユーザーは、同じ動物の核、細胞質およびシナプス画のUPS機能を調べることができ、これらの複雑な分析を行うために必要な時間と動物の数を減らすことができます。here.Abstractユビキチンプロテアソーム系は、真核生物におけるタンパク質分解および他の様々な細胞プロセスの主要な調節剤である。精神疾患に関連している。調節機構が大きく異なる可能性があるすべての細胞コンパートメントに存在することです。その結果、同じ動物内の異なる細胞内の異なる細胞内の脳ユビキチンタンパク質ターゲティングおよびプロテアソーム触媒活性を直接比較する能力は、UPSがシナプス可塑性にどのように寄与するかを完全に理解するために重要であり、記憶と病気。ここで説明する方法は、同じげっ歯類(ラット)脳からの核、細胞質および粗シナプス画分の収集を可能にし、続いてプロテアソーム触媒活性の同時定量化(間接的に、プロテアソームコアの活性を提供する)のみ)およびリンケージ特異的ユビキチンタンパク質タグ付け。したがって、この方法は、シナプス可塑性、記憶形成および異なる疾患状態の間に同じ動物における異なる脳領域におけるユビキチン-プロテアソーム活性の細胞内変化を直接比較するために使用することができる。この方法は、同じ動物内の他のタンパク質の細胞内分布および機能を評価するためにも使用することができる。Introductionユビキチンプロテアソーム系(UPS)は、細胞1のほとんどの短命タンパク質の分解を制御する相互接続されたタンパク質構造およびリチウムの複雑なネットワークである。このシステムでは、タンパク質は、小さな修飾子ユビキチンによって分解または他の細胞プロセス/運命のためにマークされます。標的タンパク質は、7つのリジン(K)部位(K6、K11、K27、K29、K33、K48およびK63)またはN末端メチオニン(M1;線形として知られている)のいずれかで一緒にリンクすることができる1-7ユビキチン修飾を獲得することができる。これらのポリウビキチンタグのいくつかは、分解特異的(K48)3であり、他のものはタンパク質分解プロセス(M1)4、5、6とは大きく独立している。したがって、タンパク質ユビキチン化プロセスは非常に複雑であり、特定のポリウビキチンタグの変化を定量化する能力は、細胞機能における与えられた修飾の役割を最終的に理解するために重要である。このシステムの研究を複雑にし、UPS7の触媒構造であるプロテアソームは、いずれもタンパク質を分解するが、他の非タンパク質分解プロセス8、9にも関与しうる。精神医学的な疾患状態に関与している。障害10,11.その結果、脳内のUPS活性を効果的かつ効率的に定量化できる方法は、このシステムが疾患状態でどのように調節されるか、およびユビキチンおよび/またはを標的とする治療オプションの最終的な開発を最終的に理解するために重要である。ラットやマウスから脳組織のユビキチン・プロテアソーム活性を定量化する上で多くの問題があり、これはUPS機能の研究に使用される最も一般的なモデルシステムであり、1)ユビキチン修飾の多様性、および2)分布および細胞外コンパートメント12、13、14を横切って機能するUPSの差分規制。記憶形成中の脳におけるユビキチン・プロテアソーム機能の初期のデモンストレーションの多くは、全細胞のライサーションを使用し、タンパク質ユビキチン化およびプロテアソーム活性の両方における時間依存性の増加を示した15、16歳,17歳,18歳,19歳,しかし、最近、ユビキチン・プロテアソーム活性は、学習に応じて細胞内の区画全体で大きく変化し、一部の地域では同時に増加し、他の地域では減少し、大きく異なるパターンであることがわかった。以前に報告されたものから全細胞は21をlysates.これは、異なる細胞内区画間でのUPS活性の変化の寄与を解離できないため、細胞全体のアプローチの制限と一致しています。最近の研究は、学習22、23、24に応答してシナプスで特にUPSを研究するためにシナプス画分プロトコルを採用しているが、使用される方法は、測定する能力を閉塞する同じ動物における核および細胞質のユビキチン・プロテアソーム変化。その結果、実験を何度も繰り返す必要が不要で、それぞれに異なる細胞分画が収集されます。これは動物の生命の損失を大きくするだけでなく、特定の事象に応答するか、特定の疾患状態の間に異なる細胞内区間でUPS活動を直接比較する能力を排除します。このニーズに対処するために、我々は最近、同じ動物21から所定の脳領域に対して核、細胞質およびシナプス画分を収集することができる手順を開発した。同じサンプルから複数の細胞分画を収集して得ることができるタンパク質の限られた量を考慮して、我々はインビトロプロテアソーム活性およびリンケージ特異的なアッセイに以前に確立されたプロトコルを最適化したげっ歯類の脳組織から採取した細胞のタンパク質ユビキチン化。このプロトコルを使用して、ラットの横扁桃体における核および細胞質におけるプロテアソーム活性、K48、K63、M1および全体的なタンパク質ポリユービキチン化レベルにおける学習依存的変化を収集し、直接比較することができた。ここでは、UPSが長期記憶形成や様々な疾患状態にどのように関与しているのかについての理解を大幅に改善する可能性のある手順(図1)を詳細に説明します。我々のプロトコルで議論されるインビトロプロテアソーム活性は、広く使用されている一方で、完全な26Sプロテアソーム複合体の活性を直接測定しないことに留意すべきである。このアッセイは20Sコアの活性を測定し、26Sプロテアソーム複合体全体とは対照的に、コア自体の活動を理解するプロキシとしてのみ役立つことができる。使用委員会(IACUC)によって承認されています。注:このプロトコルは、様々な脳領域に適用することができ、様々な組織採取手順で使用することができます。以下は、ラットの脳組織の細胞細胞に対して研究室で使用される手順で、8~9週齢の雄スプラーグ・ドーリーラットを用いたものです。同じ動物のすべての細胞コンパートメントを処理するために、セクション1.3。使用される組織採取手順にかかわらず従わなければならない。ラットの脳を抽出し、ドライアイスで事前に冷やした低温カップに入れます。ドライアイスで脳をフラッシュフリーズするか、液体窒素を使用して-80°C冷凍庫に移します。脳は、同じ日または後の時間に解剖することができます。凍結した脳を低温カップから取り出し、ドライアイスで冷やしたラットの脳マトリックスに入れます。位置を決定するために使用できます。ラットブレインアトラスを使用して、ROIの予測開始の直前(前方)のマトリックスにカミソリブレードを挿入します。次に、ROIの予測末(後部)に直ちにカミソリブレードを挿入します。メスを使用してかみそり刃の間のスライスを取り除き、ドライアイスで冷やした顕微鏡スライドの上に置きます。メスを使用して、一度に1つの半球のROIを解剖します。各半球をドライアイスであらかじめ冷やした1.5mLのマイクロ遠心管に入れます。凍結組織は、すぐに細胞下分画に使用したり、-80°Cで保存された場合は後で処理することができます。NaCl、10%NP-40(IGEPAL)および50%グリセロールを含む一般的なラボ化学物質の事前製ストックソリューションを使用しています。エンドポイントがプロテアソーム活性アッセイに使用される場合、グリセロールおよびATPは、溶解中にプロテアソーム複合体の分解を防ぐために、すべてのバッファーに添加することができる。バッファーを準備します。mLの超純物(脱イオン化および蒸留)水を加えます。