これらはアッセイブランクになります。注:ピペッティングエラーによるタンパク質体積の変化を制限するために、タンパク質濃度は最も濃縮されていないサンプルに正規化することができます。これにより、すべての条件で同じサンプルボリュームを使用できます。リピータ/自動ピペットは、ウェル間で一貫したアッセイボリュームを確保するために、ここでお勧めします。オプション:この段階では、必要に応じてインビトロ操作を導入します。これは、各サンプルが車両を含む治療ごとに追加の2ウェルを持っていることを必要とします。μLをサンプルウェルの2と同等の量の制御/車両を別の2ウェルに追加します。プレートを予め温めたプレートリーダーの上に置くか、37°Cのインキュベーターに30分間入れます。明かりを消すか、暗い部屋に入ります。μLをすべて新しいウェルに追加します。各標準は、単一の井戸を持つことになります。μLをサンプルおよびアッセイブランクを含むウェルに追加しますが、AMC規格には加えられません。リピータ/自動ピペットは、ウェル間で一貫したアッセイボリュームを確保するために、ここでお勧めします。プレートリーダーにプレートを入れ、運動走行を開始します。各標準、各サンプル、アッセイブランクの5つのスキャンの重複井戸を平均します。生の蛍光値は、サンプルのスキャン全体で増加する必要がありますが、標準およびアッセイブランクでは安定した(またはわずかに減少)。この値をアッセイで使用するサンプル濃度で除算して、標準化されたAMC値を得ることができます。各サンプルとアッセイブランク平均について、標準化されたAMC値で除算します。この最終値をアッセイで除算し、各サンプルとアッセイブランクの正規化値を取得します。つのスキャンすべてに対してこれを行います。つのスキャンすべてについて、正規化された各サンプル値から正規化されたアッセイブランク値を減算します。リンケージ特異的タンパク質ユビキチン化の定量化げっ歯類の脳組織から収集された異なる細胞分画における多様なポリウビキチンタグの定量化は、ユニークなリンケージ特異的ポリウビキチン抗体と組み合わせて様々な標準的な西洋ブロッティングプロトコルを使用して行われるべきである。脱電の場合は、正規化されたサンプルを、製造元の指示に従って、β-メルカプトエタノールを補充した同量のLaemmliサンプルバッファーと混合し、体積によって5%の割合にします。リンケージに関係なく、すべてのモノユビキチン化およびポリウビキチン化修飾の定量化のために、パンユビキチン抗体を使用する。すべてのポリユビキチン化タンパク質を認識するには、単一ユビキチン化と交差反応しないユビキチン抗体を使用します。リンケージ特異的ポリウビキチン化には、リジン-27、リジン-48、リジン-63および線形(M1)ポリユービキチン化を検出できる抗体を使用してください。NaOHを10分間使用して開発間の膜を剥切り取る。TBSで膜を0.1%の10分間2回洗浄し、再ブロックします(使用するウェスタンブロットプロトコルで好ましいブロッキング剤を使用)。二次抗体で膜をインキュベートし、膜が一次および二次抗体を適切に取り除かれたことを確認するために再開発する。推奨:汚染のない異なるユビキチン抗体の開発を成功させるには、蛍光または近赤外イメージングシステムを使用してください。これはしばしば抗体間の持ち越しを防ぐことができる。ユビキチンウエスタンブロット画像の中には、異なるバンド(M1など)の列を提供するものもあれば、明確な線がほとんどないか全く無いスミアのようなパターンを生成するものもあります(K48と共通)。画像化されたユビキチンウエスタンブロットの定量化のために、分子標準のはしご全体を拡張する柱の周りにボックスを描きます。ユビキチン染色がはしご全体に広がる場合は、ボックスを上下に調整します。これはLysine-48の修飾のために一般的であり、細胞外のコンパートメント間で広く変化する。すべての側面の柱を囲む背景の平均光学密度として計算される背景を減算します。Resultsここで説明する手順を用いて、ラット脳の横扁桃体から核、細胞質およびシナプス画画を採取した(図1)。個々の分画の純度は、ウェスタンブロッティングを介して確認され、リサート中で濃縮または枯渇させるべきタンパク質に対する抗体を調べた。低いレベルで存在した(図2A)。これは、シナプス分画調製がシナプス前成分およびポストシナプス成分25の両方を分離することを実証する以前の研究と一致している。逆に、核タンパク質ヒストンH3は核中に存在していたが、細胞質のレベルが低いシナプス分率は存在しなかった(図2B)。細胞質におけるPSD95およびH3の存在は、細胞質翻訳と一致する。細胞質タンパク質β-チューブリンは、我々の細胞質画画に存在していたが、シナプス領域の低レベルで、核溶解物(図2C)から大部分は存在しなかった。これは、細胞質タンパク質がほとんど存在しない核画分を作り出すことができたことを示唆している。シナプス領域におけるチューブリンの存在は、以前の研究26と一致している。3つの画分はすべて、負荷制御として使用されたタンパク質β-アクチン(図2D)を保持するハウジングの同様のレベルを示した。これらの結果は、単一のラットの横扁桃体から採取された核、細胞質およびシナプス画の純度を確認する。次に、全てのライサテをインビトロ20Sプロテアソーム活性アッセイの記載改変バージョンを用いて機能的プロテアソーム活性について確認した。すべてのリザートにおいて、アッセイの成功は、最初のスキャン(0分)から5番目/最終スキャン(120分)に検出された生蛍光ユニット(RFU)の増加として定義された。生蛍光ユニット(RFU)の正規化のための最高基準として使用しました。粗シナプス画では、RFUはスキャン5(図3A)でピークに達し、その結果、正規化されたRFUは0.1以下(図3B)となった。細胞質画画では、RFUはスキャン全体で増加し(図3C)、最終的に正規化されたRFUは〜1.6(図3D)である。核分数はまた、RFU(図3E)の時間依存変化を示し、最終的に正規化されたRFUは0.3(図3F)である。コンパートメント間のプロテアソーム活性の違いは、一般的に細胞質および核27で最も豊富である分画におけるプロテアソームの利用可能性を反映している可能性が高い。これは、より厳しい脱線状態によるプロテアソーム活性を減少させることができる.重要なことに、RFUはアッセイブランクまたは溶解物(シナプス)において、高特異的かつ強力なプロテアソーム阻害剤クラスト・ラクタシスチン-β-ラクトン(図3G、β-lac)でインキュベートされ、最終的な正規化されたRFUレベルを示さなかった。これは、RFUの観察された変化が特にプロテアソームの活性に起因し、他のプロテアーゼではないことを示唆している。実験条件を越えて分析した場合、核の増加があったが、細胞質的ではなく、横扁桃体の後の遊歩道活性が増加し、シナプスプロテアソーム活性の低下と同時に起こった。対照動物との比較(図4)。これらの結果は、単一のラット横扁桃体から採取された3つの細胞下画すべてでプロテアソーム活性を正確に測定できることを確認した。プロテアソーム活性アッセイの利点の1つは、プロテアソーム基板を添加する直前にインビトロ操作を試料に導入できることであり、プロテアソームを調節できる特定の分子の同定を可能にする。その特定の細胞外画分。その一例として、CaMKII(カルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII)の役割をシナプス画画で評価し、最も過酷な変性溶解物を採取し、CaMKIIはシナプスでプロテアソーム機能を調節すると考えられている。5A)を参照してください。逆に、細胞質に適用された同じ操作は、車両処理ウェルからのプロテアソーム活性の変化をもたらさなかった(図5B)。これらの結果は、プロテアソーム活性がインビトロでさらに操作され、この操作が収集された細胞下画分に応じて異なる効果を持つことができることを確認する。プロテアソーム活性の定量化に加えて、記載されたプロトコルは、ウェスタンブロット手順を用いて多様なユビキチン修飾における細胞内差を測定するために使用することができる。検出可能なユビキチンタグは、現在ラットのK48、K63、M1を含むリンケージ特異的抗体の利用可能性によって制限されることに注意することが重要です(注:K27抗体は入手可能ですが、いずれの画像でも検出可能な画像は生成されませんでした)横扁桃体画または全細胞は、様々な条件下でlysats)。/M1およびK63ユビキチン化および分解特異的K48ユビキチン化は、全ての細胞下画分で検出された。重要なことに、異なる実験条件を越えて分析した場合、横扁桃体における全体的な(図6A)、線形(図6B)、K63(図6C)およびK48(図6D)のポリウビキチン化が増加した。対照動物と比較して学習後の核分数。同時に、細胞質領域では、全体的なポリウビキチン化が減少し、K48ユビキチン化は学習後に増加し、シナプスK63ユビキチン化は減少した。これらの結果は、リンケージ特異的タンパク質ユビキチン化における同じ動物細胞内の差異が正確に検出できることを示している。ラット脳組織の細胞下分画の概略図。げっ歯類の脳は抽出され、脳領域は解剖され、半球は分裂する。一連のバッファーと遠心分離ステップを使用して、核分画と細胞質画分が一方の半球から収集され、もう一方から粗シナプス画分が収集されます。両方の画分は、プロテアソーム活性アッセイおよびウェスタンブロッティングに使用され、タンパク質ポリユービキチン化レベルをアッセイする。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。2:原油シナプス、核および細胞質画分純度の確認。シナプスタンパク質後のシナプス密度タンパク質95(PSD95;1:1,000)はシナプス中に存在したが、細胞質の低いレベルの核画分は存在しなかった。ヒストンH3(1:500)は核中に存在したが、シナプスではなく、細胞質における発現が低い分数であった。(C)β-ツブリン(1:1,000)は細胞質に存在していたが、核から大部分は存在せず、シナプス溶解物では発現が低い画分であった。ハウスキーピングタンパク質βアクチン(1:1,000)は、全ての細胞下コンパートメントに存在していた。領域は、標的タンパク質の予想サイズを示す。al.21から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。同じ動物の横扁桃体から採取した核、細胞質およびシナプス画におけるプロテアソーム活性の定量化。インビトロプロテアソーム活性アッセイの間に、検出された相対蛍光単位(RFU)は、シナプス(A)、細胞質(C)および核(E)画分におけるアッセイの開始(スキャン1)から終端(スキャン5)まで増加した。AMCに対して)を示した。プロテアソーム阻害剤βlacは、セッション全体でRRFが変化するのを防いだ(G-H)。al.21から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。同じ動物の横扁桃体におけるプロテアソーム活性の細胞内差核プロテアソーム活性の増加は、シナプス画内の活性の減少に相当する対照に対する訓練された(恐怖条件付き)動物で検出された。細胞質プロテアソーム活性はベースラインに残った。al.21から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。採取されたシナプスおよび細胞質画分におけるプロテアソーム活性のインビトロ操作。阻害剤AIPを介したCaMKIIシグナル伝達のインビトロ操作は、シナプス(A)におけるプロテアソーム活性を減少したが、細胞質(B)ではなく、ラットの横扁桃体からの分数である。al.23から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。学習後の核画分における全体的なユビキキ化の増加があり、これは細胞質画分の減少と相関した。核の線形ユビキチン化は増加したが、細胞質やシナプスではなく、学習後の分数であった。学習後の核分数におけるK63ユビキチン化の増加があり、これはシナプス画分の減少と相関した。K48ユビキチン化は核および細胞質で増加したが、シナプスではなく、学習後の分数である。0.05.得られたユビキチン光学密度は全てβ-アクチンレベル(Aの下位代表的なウェスタンブロット画像)に正規化され、これは負荷制御として用いた。al.21から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。librarian.Discussionここでは、同じ動物の異なる細胞内区画間のユビキチン-プロテアソーム活性の変化を定量化するための効率的な方法を示す。現在、ユビキチン・プロテアソーム系の活性における細胞内変化の測定のほとんどの試みは、サンプル当たり1つのコンパートメントに限定されており、実験を繰り返す必要がある。これは、多大なコストと動物の生命の損失につながります。私たちのプロトコルは、半球を分割することによって、この問題を緩和し、同じ動物の各半球から異なる細胞画分を収集できるようにします。このプロトコルを用いて、我々は、同じ動物のユビキチン-プロテアソーム活性において、学習21に応答して核、細胞質およびシナプス画の分画が差異的に変化することを初めて示すことができた。ここで説明するプロトコルの主な制限は、得られる脳組織(サンプル)の量に依存している。上記で説明したように、このプロトコルは、所定の脳領域の半球を分割する必要があります。つの半球にのみ存在する特定の領域の場合など、これは常に可能であるとは限りません。これらの場合、このバッファーはすべての変性剤を含まないため、シナプス画分ステップ(セクション3.1)で使用されるTEVPバッファー内の脳領域全体を最初に均質化することによってプロトコルを変更することができる。つの等しい部分に分割できます。最初の部分は、説明されているようにプロトコルに従って、シナプス画分に使用することができます。試料の後半では、非イオン性洗剤NP-40を0.05%の最終濃度に加え、セクション2.6に記載の遠心分離を加えることができる。これにより、細胞質タンパク質をペレットに上清タンパク質と核タンパク質に分離することができ、セクション2の残りのステップに続いてさらに単離することができます。組織量のもう一つの懸念は、いくつかの脳領域は、前肢皮質のようなサイズが非常に小さいということです。これらの場合には、上記のプロトコルは、使用されるバッファの体積を減らすことによって依然として使用することができ、これは収集された脳領域の大きさに基づいて経験的に決定されなければならないであろう。したがって、このプロトコルは、より少ない組織が利用可能であるより困難な脳領域に修正することができる。ここで概説するプロトコルの主な利点の1つは、ほとんどの施設で見られる一般的な実験装置と試薬を使用し、この方法論が限られた予算や限られたリソースの中でも修正可能であることです。ユビキチン・プロテアソームシグナル伝達における細胞内変化を測定する方法としてこのプロトコルを概説する一方で、この方法論は、細胞の局在化および機能を理解する他のタンパク質または細胞プロセスにも適用することができる。したがって、このプロトコルは、学習および記憶または異なる疾患状態の間に特定のタンパク質または複合体の細胞内機能を理解するための広範なアプリケーションを有することができる。librarian.Disclosures著者は何も開示していない。Acknowledgmentsこの研究は、農業生命科学部とバージニア工科大学の理学部のスタートアップファンドによって支援され、バージニア工科大学のジョージ・ワシントン・カーバー・プログラムによって支援されています。gdpr@jove.com.。