上澄みを回収し、UVを測定した。ポジティブセレクション用のゲルにLC-Aを400μl×4回でBufferの置換と未結合DNAの除去を行った。※9ラウンド以降はLC-Aを400μl入れてインキュベート(37°C,10rpm,5min)し、上澄みを除去(×5回)ポジティブセレクション用のゲルに溶出バッファー(5ラウンドまではLC-B、6ラウンド以降はLC-B2)を400μL加え、ポジティブセレクション用のゲルに結合しているDNAを溶出させた(5ラウンドまでは3回、6ラウンド以降は1回)。この溶液を用いてPCRを行った。ポジティブセレクション用ゲルにインキュベートしたDNA量をUVで測定し、溶出されたDNA量を変性PAGEで測定し、その割合からセレクションの進捗状況を確認した。【0033】<溶出DNAの増幅>37°Cで溶出した結合活性を示すDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことにより増幅した。DNAポリメラーゼを用いた。【0034】<一本鎖DNAの調製>*1PCR反応液を、ローターバックを用いて凍結乾燥した後、蒸留水に溶解した。CH3COONaを加え軽く混ぜ、EtOHを加え、エタノール沈澱を行った。4°C)し、上澄みを除去し、残渣を一本のマイクロチューブに回収し、凍結乾燥した。37°Cで30min反応させた。Goldで染色することにより反応の進行を確認した。λexonucleaseによって一本鎖にしたDNA溶液をエタノール沈澱させた。Urea)により精製し、これを次のラウンドのライブラリーに用いた。【0035】<アプタマーの単離および配列解析>通常のクローニング法により、濃縮したライブラリーからアプタマーの単離を行った。MRC#P1Nを用いた。DH5α(東洋紡)を用いた。生成した各コロニーからプラスミドを取り出し、それぞれ、シーケンサーで配列解析を行った。30sec→25°C(0.5°C/min)]をした。そのうち5μlを別のマイクロチューブに分注した(分注1)。ネガティブセレクション用ゲルとポジティブセレクション用ゲルそれぞれに1×LC-ATを400μl加え、ボルテックス、遠心を行い、上澄みを除去した。この操作を4回繰り返すことにより、Bufferを置換した。それぞれのゲルに30μlずつDNA溶液をインキュベートし37°C、1200rpm、1h振とうした。ボルテックスと遠心を行い、上澄みを5μl回収した。45°C)を行い、バンド強度を次式に導入することにより、標的分子への結合割合を算出した。(%)={(NEG-POS)/NI}×100ここで、NEGはネガティブセレクション用ゲルの上澄み、POSはポジティブセレクション用ゲルの上澄み、NIはインキュベート前の液(分注1)中のそれぞれのDNA量を示す。【0038】セレクションを11ラウンド行った後に、得られた配列を解析したところ、表1の結果が得られた。次に、表1で取得できた配列のうちApt4#70、Apt14#70、Apt22#69およびApt4#40、Apt4#20(コア配列)とRnd#70(ライブラリー)について、蛍光滴定によりカンプトテシン類に対する結合を調べた。bufferに溶けているDNA溶液を調製した。derivativeの構造は以下の通りである。・測定の手順1.各濃度に調製したDNAをアニーリングした。30sec→25°C(0.5°C/min)]2.2μMに調製した化合物溶液を、予めマイクロチューブに50μLずつ入れておき、そこへアニーリングした各濃度のDNAを50μLずつ添加し、ボルテックスと遠心を3回行った。(インキュベート)3.低い濃度のものから蛍光を測定した。【0051】その結果、表9に示されるように、Apt4#70、Apt14#70、Apt22#69およびApt4#40はカンプトテシン類に特異的な結合を示したが、Apt4#20とRnd#70は結合しなかった。実施例2:修飾塩基を含むDNAアプタマーのスクリーニングまず、修飾塩基を合成した。0.19mmol,F.W.60.10)を加え、還流管を設置し、オイルバスで80°Cにし、2時間撹拌した。これを吸引濾過し目的物1を得た。d=0.742g/mL)を加え、軽く混ぜた。濃縮し、吸引濾過した。後、chloroformを加え沈殿を析出させ、吸引濾過を行い、目的物2を得た。(15mL)、TEA(4.91mmol、680μL、F.W.101.19、d=0.73g/mL)を加え、10分間撹拌し、クエンチした。物を目的物として回収した。その後、少量の蒸留水に溶かし、陰イオン交換カラムで精製した。収率は、2のモル吸光係数(ε260nm=22200mol-1Lcm-1)を用いて計算した。Disulfide(128.4μmol、28.3mg、F.W.220.32)を加え、室温で3時間撹拌した。perchlorate、脱水aceton混合溶液に、反応液を加え、4°Cで30分間静置した。沈殿物を脱水acetonで洗浄し、クルードの状態で目的物として得た。inDMF(485μmol、970μL、F.W.177.98)を加え、室温で10時間撹拌した。反応終了後、クエンチのためTEAB(3.7mL)を加え、減圧留去によって濃縮した。etherで洗浄し、水相を減圧留去した。少量の蒸留水に溶かし、陰イオンカラムで精製した。HPLC精製、中圧カラム、陽イオンカラムで精製を行った。derivative1をターゲットとしたSelection(修飾型DNA)<Selectionで使用したbuffer>天然型DNAアプタマーのスクリーニングに用いたものと同じ。※これを鋳型として調製した修飾DNAがRnd'#70に該当。-3'配列番号25NはA,G,Cまたは修飾T(上記で合成した化合物5)を示す。・VIT#P1-F(5'末端FAM標識)5'-CACCAGAGGCACGCCAGACA-3'配列番号26・VIT#P2-H(5'末端HEX標識)5'-ACACGGCTAGCACGGCGAAG-3'配列番号27・VIT#P1-P(5'末端リン酸標識)5'-CACCAGAGGCACGCCAGACA-3'配列番号26・VIT#P1-N5'-CACCAGAGGCACGCCAGACA-3'配列番号26・VIT#P2-N5'-ACACGGCTAGCACGGCGAAG-3'配列番号27【0065】<アフィニティーゲルの調製>天然型DNAアプタマーのスクリーニングの場合と同じ。【0066】<初期ライブラリーの合成>*2初期ライブラリーは、VIT#T1-Hを鋳型鎖、VIT#P1-Fをプライマー鎖としたプライマー伸長反応により調製した。DNAポリメラーゼを用いた。生成した修飾DNAの一本鎖は、変性PAGEにより、鋳型鎖のVIT#T1-Hから分離精製することが可能である。30sec→25°C(0.5°C/min)]した。