示したプロットは、平均とSTAを表します3つの独立した実験のndard偏差。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。アルギン酸ビーズでカプセル化を介して、全細胞生体触媒の図2.固定。2+アルギン酸ビーズの形成を示す概略。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。2(M)濃度の関数として。示したプロットは、3つの独立した実験の平均値と標準偏差を表す。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。示されたプロットは、3つの独立した実験の平均値および標準偏差を表します。され、無料の結合された全細胞生体触媒の再利用の7連続サイクル用のL-キシルロース生産の歩留まりの図5.評価はそれぞれ、暗い部分と明るい灰色で示されています。示したプロットは、3つの独立した実験の平均値と標準偏差を表している。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。librarian.Discussion最近の技術の進歩は、バイオテクノロジー産業における市場価値の緩やかな上昇をもたらし、組換え生物学的治療薬の商業化の急増を有効にしています。そのような進歩は、スケーラブルな産業システム38の確立に大きな期待を示している組換え微生物中で代謝工学の出現です。​​、システム39の製造歩留まりに大きく依存します。これは、生体触媒酵素の定方向進化は、生体触媒活性の3を改善するために実施されている「ブルートフォース」遺伝学39、の急速な発展につながっています。このような酸化還元経路のような特定の代謝経路のために、単なる生体触媒の改善はOTHの有意な効果により生産の経済化に影響を与えることは十分ではありません高価な補因子などの必須の反応要件、えー。このようなシステムのスケールアップは、さらに改善された生体触媒を用いて、唯一の製造コストを増大させるために役立ちます。このように、追加の戦略的な方法は、補因子の化学量論比を含む生物反応の実用化のために必要とされます。生体触媒のリサイクルはまた、バイオプロセスの経済性を向上させるために必要です。急速補因子の消費量および全細胞生体触媒の乏しい再利用の制限効果を克服するために、我々は以前に補因子再生と安定した再利用16ための固定化、結合された全細胞生体触媒システムを開発しました。本研究で説明した代表的な結果とともに、改善された生体内変換収率と再利用のための実験的なカップルに必要な手順と同時固定化2全細胞生体触媒です。重要な要因は、全細胞biocatを結合するために考慮されますalystsシステムの再現性を保証するために、タンパク質誘導と生体触媒生成物の形成のために確立された条件の正確な制御を維持します。600のようなパラメータの変動、誘導時間、およびIPTG濃度がバッチ間変動を最小限にするために避けるべきです。細胞間の比率の再評価が異なる生体内変換のために必要とされます。:この研究で報告された1は、実験的最適化ではなく、理論的な化学量論比により決定しました。アルギン酸カルシウムビーズにおける組み換え全細胞生体触媒の固定化のために、ビーズの剛性と細胞の分布に関して均一性を確保するには、いくつかの重要なステップがあります。アルギン酸塩溶液をゆっくりと水にアルギン酸ナトリウムを添加することにより調製しなければならず、その逆共凝集を防止するため地元のアルギン酸塩濃度、したがって、架橋の程度に影響を与えるULD。アルギン酸塩の懸濁液を処理するときに、効率的な物質移動を妨げる採用すべきであるとさえビーズが浮くことがあります。場合には気泡が細胞アルギン酸塩懸濁液は20のために邪魔されずに放置し、懸濁液に導入されています。アルギン酸塩懸濁液を均一なサイズおよび形態のための塩化カルシウム溶液の十分なボリュームに滴下方法でゆっくりと慎重に追加する必要があります。塩化カルシウムに不完全に沈めビーズは、セル漏れに寄与することができる不規則な形状と貧しい剛性を持つことになります。最後に、残留洗浄バッファからの反応容積の変動を回避するために、ステップ4.8でビーズを軽くろ紙でブロットすることができます(空気乾燥しません)。HjLAD細胞培養物は、二つの酵素の間の所望の比を維持する上でより良好な制御を提供します。単一のタンパク質を発現する細胞は、還元されたタンパク質のミスフォールディングおよび増大したタンパク質発現40,41につながる複数のタンパク質を同時発現するものよりもストレスを受けています。したがって、直接細胞全体の結合が有意に生成物の収率を損なうことなく、多酵素触媒プロセスを媒介する能力を示します。このような様々な強度42,43およびリボソーム結合部位44の改善と細菌プロモーターを慎重に選択するような確立された戦略はemployeすることができますdは共培養または共発現システムでの標的酵素の比の制御は制限付きで緩和します。多くの固定化技術の中で、カプセル化は、精製された酵素のための、より適しているような架橋および吸着などの代替の方法、上に全細胞生体触媒を固定化するための複数の利点を提供します。細胞のカプセル化はまた、生体触媒の再利用性を向上させるために、寒天、キトサン、ゴム、カラギーナン、ゼラチン、およびアルギン酸塩45のような生体材料の様々な行うことができます。アルギン酸カルシウム封入は、固定化効率及び生体分子生産46,47に対する最も効果的なアプローチであることが示されています。これは、真核生物の生体触媒の使用の成功ワットを制限しますこのシステムをithin。この制限を克服するための代替手段は、より優れた真核生物の翻訳後の機構が装備されている酵母などの生物の使用である可能性があります。記載されたシステムの別の限界は、改善された再利用のための固定化の使用に関する。-固定化は、生体触媒の低い安定性に対抗し、バイオプロセス49を簡略化することにより、その回転率を改善するために使用一般的な費用対効果の高い戦略です。2濃度、セル負荷およびビーズサイズが含まれます。これらのパラメータは、互いに独立していないことを認識することが重要です。このように、単一試験中のすべての要因の総合的な分析は非常に時間がかかり、従って、最適化のための最も重要なパラメータを選択する必要があります。ここでは詳細に議論されていないが、我々は以前に16を固定化された細胞の重量に収量の依存性を比較し、セル負荷の最適化を行いました。文献の報告はまた、改変された輸送特性に固定化されたシステムの表面積の増大を介して活性を向上させる、酵素カプセル化を増加させることによって、または基質および生成物の拡散を変更することにより、製造歩留まりを調節し得るビーズの大きさの変化を示しています。検討中の生体触媒反応に応じて、代替の重要な要素の選択は、最適な条件の異なるセットの発生につながる可能性があり、必要な場合があります。追加パラメータの最適条件の確立のための詳細な研究は、結合された全細胞システムの性能の更なる向上のためのスコープを提供します。要約すると、我々は実験的implemenを報告しますL-キシルロースの改良された産生を示したアルギン酸カルシウムビーズに固定化された結合された全細胞生体触媒システムのテーション。他の補因子依存性の生体触媒経路を促進する別の組換え酵素を発現させることによって、多くの生物学的に関連する分子の高い収量は、ここで記述されたプロトコルを使用して得ることができます。53のための微生物のバイオセンサーとしての生体触媒の生産以外のアプリケーションのワンポット多酵素生合成のためつ以上の組み換え生体触媒を収容するように拡張することができます。librarian.Disclosures著者には、競合する金融利益を宣言しません。論文は、アルギン酸ビーズに固定化された結合された全細胞生体触媒システムを生成するための詳細な方法論を報告することを目指しています。科学的なノベルティは以前の研究16に報告されています。MCubed省によって資金を供給、韓国の国立研究財団(NRF)を介して基礎科学研究開発プログラムによってサポートされていましたミシガン大学のプログラム。gdpr@jove.com.。