オンテープ蛍光続いてトマトや他の生鮮食品の表面の粘着テープベースのサンプリングのためのシンプルなアプローチを、説明します。セル充電されたテープは、検出前に固相濃縮のための選択寒天培地に直接フェースダウンに配置することができます。少量の液体富化(液面のminiculture)はフローサイトメトリーを経由してFISHと分析に続いて、非選択培養液中のテープの表面に行うことができます。開始するには、無菌の粘着テープが新鮮な農産物と接触させ、物理的にこれらの表面上に存在する微生物を抽出し、穏やかな圧力が適用され、テープが削除されます。テープは、顕微鏡用スライドガラスの上にまで粘着側にマウントされ、サンプリングされた細胞を、10ホルマリン%(30分)と段階的エタノールシリーズを用いて脱水(50、80、および95%、3分ごとの濃度)で固定されています。55°Cで30分間、非結合プローブを除去するための洗浄バッファーでリンス短いが続く。フェニルインドール(DAPI)との結果で対比されています。microcoloniesのその場成長に許可するようにインキュベートし、上記のようFISHと顕微鏡が続きます。液面minicultureの場合は、セルに帯電したテープは、粘着面を上に配置され、シリコン灌流チャンバーが適用されているので、テープや顕微鏡のスライドの形防水チャンバー内の底部トリプチケースソイの小さい容積(≤500μL)ブロス(TSB)が導入されています。C、テープ抽出した微生物の増殖ベースの増幅を可能にする。インキュベーション後、入口ポートが開封され、細胞が分離し、混合精力的なバックで前後にピペッティング、遠心分離を介して収穫し、10%で固定されている中性緩衝ホルマリン。サルモネラ属菌の存在を明らかにするためにフローサイトメトリーを介して検査されます。FISH"のアプローチは、シンプルかつ迅速なサンプリングとトマトの表面のサルモネラの検出を提供することができます。我々はまた、ほうれん草とハラペーニョペッパーを含む生鮮食品の他のタイプを、サンプリングするためのこのアプローチを使用している。滅菌粘着テープで表面のサンプリングサンプリングに使用するテープを選択します。それはサンプリングのテープは、使いやすさのための滅菌と特別にパッケージされている。我々は、透明(光学的に透明な)一般的なオフィスのテープも使用できることを見出した。2の正方形を描画するための恒久的なマーカーを使用してください。これは、テープの一部が、食品または環境表面をサンプリングするために使用されている注目のための視覚的なガイドとして機能します。サンプリングする面に対向する粘着面とテープの"C"字型のループを形成。これを行うには、テープの背面に描かれた四角(非粘着面)(図1)に対して、親指と中指と位置と粘着末端の人差し指を保持する。サンプリングされる表面にテープを置き、軽く表面に対してマークされた領域を押してください。テープの端を放出することなく、テープの粘着面は気泡を避け、試料表面と完全に接触することを保証するために人差し指を使う。モーションを使用して、徐々に物理的に表面結合微生物を抽出し、離れてサンプルからテープを引き出します。一般的な透過的なオフィスのテープを使用してガラスの顕微鏡スライド上に、セルチャージャーテープ、粘着面を固定します。フラット、非しわになりやすい面が作成されるよう、テープの適切なテンション/ストレッチングを確認してください。これは変形/ハイブリダイゼーションの間その後の加熱中にテープのカールの問題を最小限に抑えることができます。4)寒天プレート上に直接フェースダウンテープを置くことによって行われます。テープのテンプレート/サンプルの接触部は、寒天の表面とテープの一端が緩く濃縮に続く寒天表面からテープを簡単に除去を容易にするために、ペトリ皿の側壁に付着さと同じ高さに配置されます。37°Cのサルモネラの十分な成長を可能にする。検出可能なレベルに細胞を豊かにするために必要な潜伏期間の長さは初期のサルモネラ汚染レベルに依存します。我々は8時間の濃縮後に低い初期接種から優れた微小コロニー形成を観察した。希望の濃縮期間の後、寒天プレートを開きます。テープは、インキュベーション中に、その粘着性を保持します。テープ寒天界面に形成microcoloniesの最大回収を確実にするために人差し指を使って寒天に対してテープを押してください。ペトリ皿の壁に取り付けられた端からテープをつかみ、ゆっくりと、さらに動きでそれを削除してください。上記のセクション1.5で説明したように顕微鏡スライド上に細胞チャージャーテープ、最大粘着面を、マウントします。以下"固定と脱水"の手順に進みます。液面minicultureの場合、上記のセクション1.5で説明したように顕微鏡スライド上にサンプリングに使用されるテープを固定することから始めます。次に、底部上を向いて、細胞に帯電したテープから構成されている密封されたチャンバを形成する非無菌シリコン灌流チャンバー(Coverwell、グレースバイオ研究所、(株))とテープのテンプレート化/サンプルの接触部を、カバーしています。慎重に防水シールを確保するためにチャンバーを押してください。柔軟なゲルローディングピペットチップ、室の小さな入口ポートのいずれかを経由して転送≤500μLトリプチケースソイブロスまたは他の適切な増菌培地を使用する。Cに十分な濃縮のために必要に応じて。すべての操作が良好なサンプリングと処理の慣行にしたがって行われるべきですが、ポートシールテープまたは灌流室の無菌性は、液面のminiculture時に必須ではありません。サルモネラ属の明確な差別が可能になります。サンプル自体から来ると予想非標的植物の最大の貢献と、存在する可能性がある非標的細菌から。以下"固定と脱水"の手順に進みます。表面のサンプリング用やサルモネラの固相濃縮のための。10%中性緩衝化ホルマリン。密閉式容器内に固定液を捨て(化学フードの下毒性/刺激性の蒸気への曝露を最小限にするため)。下記の"ハイブリダイゼーション"の手順に進みます。500μLの液面のminicultureのサンプルの固定用の、潅流チャンバーが開封され、かつ柔軟なゲルローディングピペットチップはenrichateを抽出するために使用されます。上下に迅速なピペッティングが、残りのテープ結合細胞の効果的な除去を保証するために使用されます。gで(5分)でスピンダウンしています。上清は廃棄され、ペレットは、10%の等量に再懸濁し、30〜60秒間激しくボルテックスれる中性緩衝ホルマリン。細胞を25°Cで30分のために固定されています次に、固定液が除去され、サンプルは次のように、細胞の保存バッファーに再懸濁する。された細胞は-20°Cで(年間)無期限に保存することができます注意:液体が(例えば、固定液または別のバッファを導入する際に)変更されるたびに、それは(ボルテックスで)完全に再懸濁させることが重要である最小限の部分(〜10から20μL)で細胞ペレット"発信"液体のシステムの。これは、凝集を防止し、個々のセルの偶数濁液が得られることを確認するのに役立ちます。下記の"ハイブリダイゼーション"の手順に進みます。材料表に記載されている商用分子生物学グレードのソリューションを用いてハイブリダイゼーション/洗浄バッファーを準備します。Mトリスは[pHを8.0]、10mMのEDTA、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムは、分子のグレードの水と最終的な目的のボリュームに構成し、0.22μmのシリンジやカップのフィルターを使用してフィルタリングされます。プローブを添加していない同一のバッファは、(下記参照)、洗浄バッファーとして使用されます。63(クッターら、2006;。3'予熱したハイブリダイゼーションバッファーに)オリゴヌクレオチドプローブ(材料表)。ngのμL-1各プローブなど)が使用されます。20枚のスライドを同時に処理することができます。mLのポリプロピレン遠心チューブ、チューブごとにスライドに配置されます。熱伝達が直接ではないため、これらのサンプルは、より長い期間(最長30分)にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、スライドが削除され、プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーのオーバーレイは破棄されます。mLポリプロピレン製遠心チューブに浸漬。我々の経験では、正式な洗浄が改善された結果を(非連結プローブから以下ヘイズ)を提供しますが、簡単なリンスはサルモネラ属の明確な検出に適しています。次に、スライドの下に"検出"のステップに移る前に空気乾燥する。gで5分間(-20°Cでたての固定または記憶バッファに保持されている)サンプルをスピンダウンして実行されます。サンプルは55°Cでハイブリダイズしている500°CμL予熱した洗浄バッファーを添加し、続いてヒートブロックまたは他の適切なインキュベーションの駅(材料表)、上で30分間。minでこの洗浄バッファーでC、にのためにまで洗浄することができる。サンプルは徹底的に分析するための即時の収穫(下)に続いて、500μL予熱した洗浄緩衝液の添加後ボルテックスすることができます。サルモネラ属菌を検出するための準備に。xgでスピンダウンしている、上清を捨て、サンプルは300μL室温に再懸濁している(〜25°C)PBS。サンプルは遠い施設への輸送が必要な場合は遅延がハイブリダイゼーションと解析との間で期待されている場合、または、サンプルは前のANAに冷蔵または氷の上で開催することができる溶解。ステッチャー、2009B)。検出サルモネラ属の上にテープを検出するため。フェニルインドール(DAPI)、カバースリップをマウントした、と重ねてその後、10分間暗所でインキュベートした。液浸油は、カバースリップ上に配置され、そしてサンプルは、高倍率の油浸対物(63xまたは100倍)を用いて検討されています。DAPIフィルターが焦点に試料をもたらすために使用されている、顕微鏡は、適切なフィルターに切り替えられます(緑または赤、エンドラベルプローブするために使用される染料に応じて)およびサルモネラの細胞は、それらの蛍光(図にしたがって視覚的に採点されます2と3)。液面のminicultureサンプルのサイトメトリー検出のために、様々な楽器がローカル可用性に応じて、使用することができます。nmの(材料表)で励起したFACSCantoフローサイトメーターを用いて検討している。合計細菌の高い数字を含む豊かなサンプルについては、"低流量"の設定は(10μL分-1)が使用されますと5,000-50,000イベントが収集されます。データはFlowJoソフトウェア(バージョン8.8.6、ツリースター社、オレゴン州アッシュランド)または他の適切な解析ソフトウェア(図4、パネルAおよびB)を用いて分析されています。