600)で測定した光学密度との相関関係は、実験を容易にするために確立することができます。mlまで反応容量をもたらします。注二つ全細胞生体触媒量の比は、生成物の生合成を改善するために最適化することができます。図1B)のために最適であることが見出されました。C、8時間、200rpmで反応混合物をインキュベートします。4°Cので遠心分離後の上清を回収し3200×gで10分間aについてndは以下の手順3で説明したように、L-キシルロース生産を定量化するために進んでください。L-キシルロース定量化のための3比色アッセイ吸引し1.5mlチューブにステップ2.4​​から収集した反応上清100μl。エタノールに溶解し、1.5%のシステインを50μl、70%硫酸を900μlの、および0.1%のカルバゾールの50μlを添加し、チューブを3回転倒混和します。C、20分間200rpmで反応混合物をインキュベートします。分光光度計を用いて560nm(560)で反応混合物の吸光度を測定します。560読み取り値が1を超える場合、反応混合物を希釈します。アルギン酸カルシウムビーズにおける組換え全細胞触媒の4固定化100mlの蒸留水に4gのアルギン酸ナトリウムを溶解します。Sを加えることによりアルギン酸塩溶液を調製します塊の形成を回避するために水に憎悪アルギン酸。必要に応じて、混合液を加熱しました。SpNoxは、ステップ4.1で調製し、気泡の形成を避けるために、穏やかなピペッティングにより細胞およびアルギン酸塩を混ぜます。M塩化カルシウムに滴下混合物を追加します。注:アルギン酸塩の液滴が完全に水没するためのアルギン酸ビーズ形成のために使用される塩化カルシウム溶液の量が十分でなければなりません。注射針および塩化カルシウム溶液の表面との間の距離が均一に球状のビーズの形成を確実にするために最適な範囲内に維持されなければなりません。最適な距離範囲は、実験を決定することができます同盟国とは、針の内径に依存します。cmの(内径)注射針のために最適であることが見出されました。2溶液中のビーズを残します。2溶液をデカントし、そして別の50mlコニカルチューブに塩化カルシウム溶液中に残っているビーズを転送します。2および非カプセル化細胞を除去するために3回の緩衝液を50mMトリス-HCl(pH8.0)10mlでビーズを洗浄します。任意のステップで、それらを破裂するようにすることなどのビーズを遠心分離しません。溶液からビーズを分離するために、サスペンションは3静置することができます。ビーズを底部に沈降し、洗浄緩衝液をデカントすることができ別の容器に。使用する洗浄緩衝液を廃棄しないでください。2溶液で使用トリス塩酸洗浄緩衝液(30ミリリットル)をプールします。2およびトリス塩酸溶液を遠心分離により大腸菌細胞を20分間3200×gでステップ4.6から収集しました。Lでペレット化し、非カプセル化された細胞の密度を計算します。チューブにステップ4.6から洗浄したビーズを転送します。3.4を細胞ペレットの代わりに、洗浄したビーズの全てを用いたL-キシルロース生合成を評価します。L-キシルロース生産のための固定化生体触媒の5安定性アッセイステップ4.8からビーズを収集し、(ステップ4.6で説明したように)遠心分離することなく、50mMのトリス-HCl(pH8.0)緩衝液10mlで二回洗浄します。工程2.2に記載のように洗浄したビーズの反応を実行します。繰り返して、5.1を繰り返します。図2)の中に固定化することにより改善されました。SpNox細胞を有効にするために結合させました補因子再生。HjLAD比を行いました。HjLAD比が0.13から増加しました。比の場合に得られた収率は1:1と1.33:1がこの結合系の等価と最大でした。図1C)の収率を示します。mMのL-キシルロースを産生しました。全細胞生体触媒の固定化の最適化アルギン酸カルシウムビーズ中の生体触媒の固定化は、バイオリアクター内の物理的ストレスから細胞を保護する軽度のゲル環境の結果として、そのような改善された生存性など多くの利点を提供しています。これらのアルギン酸ビーズの特性は、主に、製剤と処理パラメータ34によって決定されます。2濃度を評価しました。これらは今度は生体触媒の固定化効率と分子拡散に影響を与えるアルギン酸カルシウムビーズの整合性と剛性を決定する主要なパラメータ。2溶液中の細胞の大部分を放出し、低い機械的安定性に脆く、簡単に壊れていた(データは示さず)。図4)に至る硬化しました。2濃度を変化させると、生体触媒でも同様の傾向が得られたimmobilizatイオン効率。2濃度は、ビーズの剛性が低下し、周囲の溶液中の細胞の漏出が増加をもたらしました。2+イオンの限られた利用可能性です。2濃度を増加させるとわずか生体触媒の固定化効率を向上させます。2濃度は評価しませんでした。2を使用した場合、生体触媒を含有するアルギン酸ナトリウム滴が塩化カルシウム溶液中に離れて落ち、全くの球状ビーズ(データは図示せず)を形成しませんでした。2濃度を落とすことなく、生体触媒の固定化効率は次の改善された、L-キシルロース産生のために最適化しました。図4(a)固定化効率と同じ濃度範囲を使用して)。この最適濃度を超えると、収率が減少する傾向を示しました。これは、アルギン酸カルシウムビーズの過度の剛性に関連した拡散における問題のために、予想されました。図4B)であることが見出されました。M)に示すデータと組み合わせ適切な剛性および透過性は、最小限の細胞の漏出および最大L-キシルロース生産歩留まりを可能に設立されました。固定化生体触媒の全体的な触媒効率に影響を与える別の要因は、カプセル化された細胞培養物の重量であることに留意すべきです。それは減少傾向37を示し、これを超える最適な接種重量のために、細胞接種物を増加させると触媒効率が高くなります。この減少のための可能な説明は、アルギン酸カルシウムビーズを通して分子拡散を妨げ、システムの触媒効率を低下させる携帯過密、です。16(データは示さず)。以下のための固定化と自由ホールセル生体触媒の再利用L-キシルロース生産。図1C)のより低いのみ32.5%でした。この減少は、固定化は、生体触媒の活性が低下することが知られているように、拡散制限を基板に起因する可能性が、予想されたが、固定化の際に生体触媒の改良された再利用性の利点によって補償されました。生体触媒の安定性に対するこの効果はあります図5に示すバッチ反応プロセスに繰り返し自由で固定化されたシステムを施す上で観察されたL-キシルロース収率の減少傾向によって実証。無料システムの収率が示す、固定化されたシステムよりもはるかに急勾配の減少を示しました。フリー系における酵素活性のより迅速な喪失。その結果、両方のシステムが連続した再利用の7サイクルの終わりには、生産サイクル2で同等のL-キシルロース収率を持っていた、カプセル化された生体触媒は、その安定性を維持し、無料の全細胞つつ、オリジナルの収量の65%を保持していましたシステムは、L-キシルロースを産生するその能力の10%未満を保持しました。これは、固定化生体触媒は、L-キシルロースの生産のために有効に再利用することができることと改善された再利用性と安定性の利点は、以上の製造プロセスに重要な利点を付与する、はるかに生体触媒の活性の低下を上回る固定化によってもたらされたことを示しています無料の全細胞システム。L-キシルロースの生体触媒の製造のための1結合ホールセルシステムの図。E.を含む結合された全細胞系で発生する補因子再生反応を示す(A)概略それぞれ、HjLADまたはSpNoxを保有する大腸菌細胞。