胸部の空洞内の空気またはガス)を引き起こす可能性のある左丘の縫合結び目を切断しないように注意してください。1つの縫合糸で胸壁を閉め、筋層と皮膚層を5〜6本の中断縫合糸を用いて縫い合わせる。注:外科用縫合針を心臓から離してください。不慮の心臓穿刺は即座に死に至る。ポビドンヨードで手術部位を消毒する。2.プロテーゼインプラントPNX処置のステップ1.1〜1.13を実行します(つまり、マウスの左肺葉を取り除いた時点まで)。)を使用して、シリコンプロテーゼの中心(顧客が作成した、長さ12mm、厚さ3mm、幅7mm、0.2g、楕円形)を締め付けます。シリコーンプロテーゼを挿入する前に滅菌する。胸腔を露出させるために片手で鉗子でリブを保持し、もう一方の手で左の空の胸腔にプロテーゼを挿入します。プロテーゼを挿入するときは非常に優しい。過度の力は胸膜破裂をもたらす。鈍い鉗子でプロテーゼの向きを調整して、プロテーゼが左の空の胸腔を占めるようにします。マウスPNX手順のステップ1.14-1.16を実行します。cmのフレキシブルチューブからなるカスタムデバイス(「膨張チューブ」)を準備します。ピペットの上部と実験台との間の距離は、少なくとも30cmでなければならない。20gを溶解し、手動で振とうして新鮮な4%パラホルムアルデヒド(PFA)固定液を調製する溶液が透明になるまで10分おきに静置する。室温に冷却した後、溶液を0.45μmフィルターで濾過する。注意:PFAを取り扱うときは、適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。mLヘパリン)で犠牲にする。ポリスチレン解剖プレートに各マウスを固定し、70%アルコールを噴霧する。注意深くマウスの胸を開き、はさみを使用して胸骨を切り開いて肺葉を完全に露出させます。はさみを使用して過剰な組織を除去し、気管を露出させる。食道から気管を離してください。腹部大動脈を切断し、心臓の右心室に25ゲージの針を挿入する。mLシリンジに接続してください。PBSを心臓に押し込み、血球を除去します。典型的には、5~10mLのPBSが肺血管を浄化するために必要とされる。あなたを埋める4%の新鮮なPFAを含むカスタムビルドのインフレーションチューブを取り出し、インフレーションチューブからすべての泡を除去します。インフレーションチューブの18ゲージの針を気管に挿入し、液体漏れを防ぐために気管クリップで気管をクリップする。2、20°Cで4%PFAで肺を膨らませます。完全に拡張した肺を達成するために、肺を室温で2時間インキュベートする。この「予備固定」工程は、肺の形態を維持するために重要である。膨張チューブを監視することにより、最初の4%PFA量の値を記録し、最終量を記録する。内部肺容積は、初期4%PFA容積から最終4%PFA容積を差し引いた容積に等しい。気管をLigateし、はさみを使用して、周囲の結合組織から肺を静かに(肺をそのままに)解剖する。肺の損傷を避けるために、非常に穏やかにしてください。rpm)で穏やかに振とうしながら肺を栓をする。組織の処理と染色に進む(セクション4を参照)。Scissorsを使用して、肺から心臓や過剰な結合組織を整えます。肺葉を気管に接続する気管支を切断することによって、個々の肺葉を静かに分離する。PBS(30分/洗浄)で3〜4回肺葉を広範囲に洗浄します。最後の洗浄後、組織が50mLコニカルチューブ(約12時間)の底に沈むまで4°Cで30%ショ糖溶液(1×PBS)に浸すことによって肺葉を凍結保護する。(OCT)化合物を含有するペトリ皿に試料を完全に浸漬する。クライオホルムを使用して液体窒素中でOCTに埋め込まれたアクセサリーローブサンプルを凍結させる。ローブの最大表面積をモールドの底面に平行にします。組織学的分析のために凍結切片作製中に、各試料について合計3つの厚さ10μmの切片を調製する。最初の1mmの組織を捨て、10μmの厚さの部分を1枚集め、0.5mmの組織を捨て、別の部分を集め、0.5mmの組織を捨て、第3の(最終)部分を集める。H&E染色を行う前に、セクションを1時間風乾します。H&E染色を行う水道水の3〜4回の切替えで切片を洗浄し、新鮮なヘマトキシリン中の切片を2分間染色する。;実行中の水道水の下でセクションをすすぎます。切片を1%HCl-70%エタノール溶液に2回浸して過剰のヘマトキシリンを除去する。新鮮なエオシンの切片を3分間染色する。95%エタノール中で2回連続して30秒洗浄し、100%エタノールで2回30秒洗浄することにより切片を脱水する;キシレン中の切片を30秒間透明にし、清澄化工程を新鮮なキシレン中で1回繰り返す;カバーガラスを使用してスライドをマウント媒体でマウントします。用いて、H&Eで染色されたアクセサリーローブ切片(20倍の倍率)のデジタル画像を取得する。MLIを定量化するには、3つのセクションからなる適切な領域(動脈および静脈、大気道および肺胞管なし)から無作為に合計15個の非重複ビュー(1,000μmx1,000μm)を選択します。10個の均等に配分された垂直線と定義されたlenの均等に分布した水平線10個でグリッドを配置する選択された領域にルーラーツールを使用してgth(1,000μm)を表示します。1つの切片の値を、2つの隣接する肺胞上皮の間の線形長さとして定義する。各1,000μmの長さのラインに沿ったすべての切片の値を測定する。各グリッドについて、10本の水平な1,000μmの長さのラインと10本の垂直な1,000μmの長さのラインの間のすべての切片の値を定量化する。注:MLIは、アクセサリーローブのそれぞれについて用意された3つのセクションの中から分析された合計15個のグリッドからの切片長の平均値である。ILVの測定についてはセクション3を参照し、MLIの定量化についてはセクション5を参照してください。Resultsここでは、PNX治療群と人工器官埋め込み(義肢植込み)群の実験を行った。これらのグループ分けは、研究グループ14の以前に発表された研究で使用されたグループ分けと同じです。マウスPNXおよびプロテーゼ移植手順を図2に示す。8週齢のCD-1雄マウスを手術および定量のために使用する。図2A)を切除したローブ。図2J)を除去した後のプロテーゼ注入群、左肺葉の大きさと形状を模倣プロテーゼに胸部に挿入しました。