式1を用いてISAを計算した。表1は、すべての肺のILV値、MLI値、およびISAを示す。補綴移植されたマウスのISAは、PNX処置マウスのISAよりも有意に小さかった。これは、挿入プロテーゼのnがPNX誘導性再生を損なう。図1:マウス気管内挿管および機械的換気。)喉頭鏡検査による20Gの静脈内挿管カニューレによる気管内挿管。)手術前に、完全に麻酔したマウスを圧力制御の機械的人工呼吸器に接続する。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。)皮膚と筋層を切断します。ストップb外科手術中に高温焼灼器を​​用いて穿孔する。番目の肋間腔に1.5cmの切開を作る。)鈍い鉗子で左肺葉を引き出し、肺動脈および気管支を同定し、肺門に結紮する。矢印は、左肺葉の肺動脈および気管支を表す。)結紮から3〜4mmで左肺葉を切除した。)左胸腔にプロテーゼを挿入します。)自発呼吸の動きが始まるまでマウスを監視する。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。図3:残りの右肺の内部肺容積(ILV)の測定。)内部肺容量を測定するためのカスタムデバイス(「膨張チューブ」)。)PNX処置群および補綴物移植群の残りの右肺のILV(平均±SEM)を、PNXの14日後に測定した。<0.01、スチューデントt検定。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。図4:残りの右肺におけるアクセサリーローブの平均線形迎え(MLI)の定量化。)マージされたイムアクセサリーローブセクションの年齢が示されています。)所定の長さ(1000μm)の10本の等間隔の垂直線および10本の等間隔の水平線を、選択された領域に配置した。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。図5:PNX処置肺および義肢移植肺におけるMLIの定量。図4Bの拡大図3を示す。二重矢印のある赤色の線は、1つの線形切片の長さを表します。)MLI値(平均±SEPNX処置マウスおよび義肢移植マウスの副葉のPNX(P。M.)を、PNXの14日後に測定した。<0.05、スチューデントt検定。スケールバー:100μm。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。742.98表1:PNX処置マウスおよび義肢移植マウスのISA値の計算。PNXの14日後のアクセサリーローブのILV、MLI、およびISAの値。librarian.Discussionこのプロトコールでは、マウス左肺PNXおよび人工器官移植後の肺パラメータの測定についての詳細な説明を提供する。おける呼吸機能の評価のための重要なメトリックであると考えられている。肺研究の共同体はISAの有用性について有用な指標として合意されているが、ISAを計算するために使用されるILVとMLIの測定の標準化についてはほとんど考慮されていない。明らかに、測定と同様に、偏りのないデータを取得することが重要です。現在の研究努力の中心的な目標は、マウス肺研究共同体による使用のための標準化されたプロトコルを確立することである。私たちは、このプロトコルを開発したときに、さまざまな方法で測定バイアスの原因を減らそうとしました。我々は、ILV測定値の変化が赤色であり得ることを見出した気管に挿入された針の寸法が寸法的に一致していることを保証することによって流体の漏れを防止することによって(18ゲージ針がマウス気管に密接に適合していることがわかった)また、PFAの膨張前にマウスの胸壁を完全に除去する必要があることも判明しました。これは、胸壁がILV測定に与える影響を最小限に抑えるためです。MLI値は、肺胞形態に大きく依存する。したがって、年齢が一致した性マッチングしたマウスを使用することの重要性に加えて、肺固定処置中の肺胞形態の適切な維持が極めて重要である。Oの経肺圧で肺を膨らませた。私たちの経験では、圧迫の程度が低くなると、組織の収縮、異常な肺胞形態につながり、最終的にはMLI値が低くなります。観察私たちの以前の研究は、PNX再生の後、残りの肺の副葉が他の3つの肺葉と比較して最大容積膨張を示すことを示した。MLI)21、22、23、24を示します。したがって、異なる肺葉からの変化を避けるために、付属葉の切片のみを分析した。MLIの定量化に使用される様々なセクション間のばらつきを軽減するために、埋め込み時のローブの向きを制御しました。ローブの最大表面をクライオドールドの底面に平行に配置しました。我々はまた、切片の厚さ、切片サンプリングの順序、および切片化中の切断位置を注意深く制御した。肺胞管を、MLIの定量化の間に評価される組織領域から除外する必要があることである。動脈、静脈、および肺胞管はすべて肺胞よりも(4〜10倍)大きいため、これらの大きな構造物を除外することは信頼できる傍受測定を得る上で重要です。各群について、5匹のマウスが定量に適している。各マウスについて、副葉の3つの切片の適切な領域(動脈および静脈、主要な気道および肺胞管なし)から無作為に合計15個の重複しない視野(1,000μm×1,000μm)を選択した。サンプル包埋法およびMLI測定は、パラフィン処理した肺組織にも適用することができる。他のものは、MLIを、総ライン長を横切った肺胞壁25のインターセプト数で割ったものとして定義したが、ここでは線形長さとして線形切片を使用したMLI計算における2つの隣接する肺胞上皮壁の間で、MLIデータから間葉の厚さを無視する。したがって、我々はILVを用いてISAを計算したが、総肺容積は計算しなかった。PNXおよびプロテーゼ移植手順の場合、PNXを受けたマウスの生存率は85%〜90%の範囲であった。プロテーゼ移植を受けたマウスの生存率は約80%であった。すべての外科手術の間に、マウスの生存を改善するためにいくつかのステップを取る必要があります。1)気管内へのカテーテルの適切な挿入は、PNX手術の成功の前提条件である。喉頭鏡のガイダンスでは、気管挿管を安全かつ効果的に行うために、気管を容易に観察することができる。2)手術中に肺や心臓を穿刺しないでください。5番目の左肋間腔の胸郭が広く開けられていること、および左葉の肺門が肺葉切除の前に明確に確認されていることを確認します。左肺葉再発を行う場合肺出血および/または肺葉破裂を避けるために、鈍い鉗子を使用して左葉が損なわれていないことを確認します。創傷閉鎖時には、手術針の先端を心臓や肺から離してください。3)余分な力が胸膜の破裂を引き起こす可能性があるので、空の胸腔にプロテーゼを挿入するときは穏やかにしてください。4)術後低体温がマウスの罹患率を増加させることが知られているので、マウスを38°Cのサーマルパッドに置き、感覚が回復するまでモニターする。左肺葉の除去後、肺呼吸器ユニットおよび肺内ガス交換領域の両方が有意に減少した。手術後14日目に、残りの肺組織中のILV、MLI、およびISAは、PNX処置群のマウスが義肢移植群よりも有意に大きく、補綴物の挿入がPNX誘発肺胞の閉塞を強く示唆した再生。したがって、PNXおよび人工器官移植マウスモード機械的な力によって引き起こされた再肺胞化の間に起こる細胞および分子事象の調査のための強力なツールとして使用することができる。日目の対照肺のISA値よりも有意に小さく、このプロトコールは遺伝的突然変異マウスの再生障害の検出にも適していることが示された。この研究で提示された厳密で標準化された定量法は、発達研究における肺パラメータおよびISA、ならびに慢性閉塞性肺疾患の肺気腫、肺損傷後の肺胞再生および肺発生を含む、複数の疾患の遺伝的に改変された動物モデル欠陥。librarian.Disclosures著者は何も開示することはない。Z17110200040000)の支援を受けました。gdpr@jove.com.。