Achievements雌雄を連続するスペクトラムとして捉え、性スペクトラム上での定位(オス化・メス化のレベル)と移動(オス化・メス化のレベルの変化)を制御するメカニズムを解明することが、性の本来の姿を理解するために必須である。本研究では、内分泌要因(性ステロイド)と遺伝要因(性染色体上の遺伝子)による性スペクトラム制御の分子基盤を明らかにする。Ad4BPと性染色体上のヒストン修飾酵素遺伝子によって制御される代謝活性の強弱が、細胞の性スペクトラムを制御するとの観点から、以下の成果が得られた。精巣のライディッヒ細胞は男性ホルモン産生を担う。この細胞は胎仔精巣で出現し、胎仔のオス化には不可欠であるが、その分化メカニズムは不明である。胎仔精巣の間質にはライディッヒ前駆細胞を含む細胞集団が存在する。1細胞シークエンス法にて前駆細胞と思われる細胞集団の存在を確認するとともに、前駆細胞に発現する数個の遺伝子を同定した。Tmsb10はその遺伝子の一つで、細胞骨格の形成に寄与するアクチン重合を抑制する分子としての解析が進んでいる。現在本遺伝子とヘッジホックシグナルとによる胎仔ライディッヒ細胞の分化機構を解析している。骨格筋は雌雄で大きさと強さが異なる。性ホルモンと性染色体が、この性差を制御する要因と考えられる。本年度はこれら二つの要因によって影響を受ける骨格筋に着目し、筋繊維を区別しながら、性腺摘出マウスとその後の性ホルモン処理マウスの筋繊維を調製し、トランスクリプトームを取得した。胎仔型ライディッヒ前駆細胞を含む細胞集団の約400細胞より1細胞トランスクリプトームを取得し、前駆細胞集団の特定、ならびにその細胞集団に発現する遺伝子を得ることができた。Tmsb10はその遺伝子の一つで、細胞骨格の形成に寄与するアクチン重合を抑制する分子として解析されてきた。この遺伝子をノックダウンすると胎仔型ライディッヒ細胞への分化が完全に抑制された。DHHは胎仔型ライディッヒ細胞の分化に必要で、精巣再構築系でヘッジホックシグナルを活性化すると胎仔型ライディッヒ細胞が短時間に分化し、その数も増加する。そこで、ヘッジホックシグナル存在下にTmsb10をノックダウンしたところ、胎仔型ライディッヒ細胞への分化は完全に抑制された。骨格筋の大きさや強さなどの性差は性ホルモンと性染色体が制御する。種々の骨格筋にてこの二つの要因が骨格筋の遺伝子発現に与える影響を調べた。雌雄の性腺摘出マウス、その後に性ホルモン処理を行なったマウスの骨格筋を対象とした。骨格筋には性質の異なる筋繊維(遅筋と速筋)が混在するため、これらの筋繊維を区別しながら、筋繊維ごとのライブラリーを作成した。現在、トランスクリプトームの取得に向けシークエンスを行なっている。遺伝要因の寄与を問うに当たり、性染色体にコードされる4種のヒストン脱メチル化遺伝子(SMCX、SMCY、UTX、UTY)に着目している。これらの遺伝子のノックアウトマウス、またこれらの脱メチル化酵素の標的サイトをChIP-seqにて同定するため、FLAG-tagを挿入したマウスを作出している(UTY以外は作出済み)。同時に少数細胞で行うことができる新たなChIP-seq法の予備実験を進めている。精巣ライディッヒ細胞における性スペクトラムの制御機構ヘッジホックシグナルが胎仔型ライディッヒ細胞の分化を誘導し、このシグナルの下流にTmsb10が関与するステップが存在すると考えられる。一般に、ヘッジホックシグナルの下流では転写因子Gliが活性化され、標的遺伝子の転写を活性化する。加えて、この経路とは別にRasの活性化を通じ、MAPKカスケードの活性化を引き起こす経路も存在する。興味深いことに、アクチン重合の制御を行うと考えられてきたTmsb10にはRas-Rafの結合を阻害することで、MAPKカスケードを抑制するとの結果も報告されている。これらの論文を参考に二つのヘッジホックシグナル経路に着目しつつ、胎仔型ライディッヒ細胞の分化メカニズムの解明に向けた研究を継続している。前駆体細胞からライディッヒ細胞に分化する際にはAd4BPの発現が大きく増加する。ヘッジホックシグナルはエネルギー代謝を活性化するとの報告もあり、ヘッジホックシグナルの最終標的がAd4BPであるとの推測も可能である。性腺摘出マウスの雌雄の骨格筋と性ホルモン処理マウスの骨格筋のトランスクリプトームを比較することで、性ホルモンと性染色体の遺伝子発現レベルでの役割分担が明らかになる。発現変動が見られる遺伝子の制御には男性ホルモン受容体、女性ホルモン受容体、ならびにSMCX、SMCY、UTX、UTYなどのヒストン脱メチル化酵素が関与する可能性を見据え、これらの因子がどのような遺伝子座に結合するかをChIP-seqによって明らかにする。男性ホルモン受容体、女性ホルモン受容体については研究分担者が、ヒストン脱メチル化酵素については我々が行う。後者については、これらの遺伝子ノックアウトマウスとこれらの因子を認識できるようFLAG-tagを挿入したマウスを作成している。