平成24年度の研究をさらに進展させた。Odf2の変異分子の解析による、そのアペンデージの制御機構の解析は、微小管との相互作用の分析について、蛍光染色法を用いた解析を進めた。新規Odf2関連基底小体アペンデージ蛋白質の探索として、Odf2関連アペンデージ蛋白質について、新規性のある蛋白質を、免疫沈降、及び、基底小体単離法の開発により生化学的/細胞生物学的探索を進めた。具体的には、(1)免疫沈降によるOdf2関連蛋白質の探索:複数の抗体(抗Odf2-N末、C末抗体)を用いる。Odf2のノックアウトF9細胞や、変異細胞、そして、種々の変異Odf2遺伝子を発現させた細胞について試みた。(2)機能ドメインの共沈降による探索:Odf2-KO-F9細胞に種々の変異Odf2分子を発現させることにより、基底小体の2種類のアペンデージ構造であるAfやBfの各々の構築に重要なOdf2の機能ドメインを特定し、これらの機能ドメインの結合蛋白質の差異を検討し、AfやBfの特異的機能とその動態を検討した。具体的には、(1)気管上皮細胞や種々の培養細胞を用いる。おける基底小体配向原理について、アペンデージ構造と細胞骨格の相互作用という視点からその原理の追求を行う。(3)気管からの基底小体の単離精製による探索:基底小体の丸ごとの単離精製法の開発を進めた。(4)本解析に供するために、気管上皮の初代培養系の立ち上げも行った。Odf2関連アペンデージ蛋白質の機能解析についての進展は大きかった。KO-F9細胞に対して種々のOdf2変異遺伝子を再導入することで、複数種の変異Odf2発現細胞を作製した。すると、一部の細胞では繊毛形成が確認され、他の細胞では繊毛形成が見られなかった。この結果は、繊毛形成に必須なOdf2領域の存在を示唆した。用いることで、基底小体を三次元的に解析すると、Odf2の遺伝子に応じて3種類の基底小体が現れ、繊毛形成にはDAの存在が必須であることが分かった。この結果から、DAの機能は繊毛形成の制御であることが示唆された。次に、SAの機能を調べるため、基底小体周囲に分布している微小管に注目した。MTOC)として機能し、その付近には多くの微小管が分布していることが知られている。2005)、すでに形成された微小管ネットワークの安定性について検討を行いました。それぞれの細胞における微小管の安定性を解析したところ、SAを欠失した細胞は微小管の脱重合ストレスに対して脆弱であることが分かった。この結果から、SAの機能は基底小体周辺の微小管の安定化であることがわかった今後の研究の推進方策(1)新規Odf2関連基底小体アペンデージ蛋白質の探索:新規Odf2関連基底小体アペンデージ蛋白質の同定・解析をさらに進める。これら新規蛋白質について、そのOdf2/基底小体/微小管との結合における機能的重要性や、基底小体の配向・整列・アピカル膜へのターゲティングにおける役割を解析する。appendagesに結合する蛋白質を見出しており、細胞周期制御におけるこれらの蛋白質の機能解析を進める。(2)Odf2変異マウスおよびノックアウトマウスおよびその初代培養細胞を用いた系において、Odf2の生体および細胞レベルでの機能解析を進める。Odf2変異マウスでは、Odf2の細胞アピカル膜へのドッキング、分子ドメインの機能、PCPにおける役割などの構造機能連関の解析をさらに進める。Odf2の完全ノックアウトマウスでは、コンディショナルノックアウトマウスを用いた初代培養系の確立と解析により、Odf2の細胞レベルでの機能解析を行う。本解析では、マウス個体では致死になることで困難なOdf2の分子レベルでの解析の進捗が見込まれる。(3)Odf2の担う基底小体の整列における役割について解析を進める。(ALI)を用いて、アピカル膜の構築についての経時変化(成熟)について、解析する。これまでの解析から、多繊毛/基底小体の整列における微小管・中心体系の重要性については知られているが、アクチンなど他の細胞骨格については、その関連蛋白質を含め、十分な解析が存在しない。本項では、こうした解析も加えて進める。