JavaScriptを有効にして再度、お越しください。ログイン~2013年の「ノーベル物理学賞」はヒッグス粒子の理論を提唱した物理学者ヒッグス氏とアングレール氏が受賞しました。KEKの岩崎先生がヒッグス粒子についてのご発表資料をリポジトリで公開されています。ご興味のある方120教材→05サイエンスカフェへをご覧ください。同様にKEKの中村先生のヒッグス粒子についてのご発表資料は、120教材→01中高生のための科学セミナーにございます。OA~」をアップしました。●2019年3月修了者の博士論文をアップしました。●2019年9月修了者の博士論文要旨をアップしました。ヘム(鉄-ポルフィリン錯体)を活性中心に持つヘムタンパク質は生体内に広く存在し、様々な役割を果たしている。個々のヘムタンパク・酵素の機能の違いはヘム近傍構造の違いに起因していると考えられる。そこで本論文では、ヘム酵素に見られる構造因子をミオグロビン(Mb)内に再構築することにより、酵素活性やヘムの配位構造に与える影響を検討した。本研究の結果、Mb変異体を用いて初めてシトクロームP450型の芳香族分子の酸化反応が進行することを明らかにし、さらに、カタラーゼを規範として、安定なチロシン軸配位子を持つ5配位高スピン型構造を構築することに成功した。I)の直接観測を初めて可能にした。Mbを作成し、その酸化活性を測定した(図1)。Iが生成する過程においてTrp-43が酸化的に修飾されていることが明らかとなり、その酸化修飾機構について検討した。Mbに比べて3-4倍の速度で酸化された(表1)。Iの生成過程にある事から、トリプトファンは過酸化水素との反応性を向上させていると考えられる。同様な傾向はチオアニソールのスルフォキシ化およびスチレンのエポキシ化反応(2電子酸化)でも観察された(F43W>WTかつF43W/H64L>H64L)(表2)。Mbに対して20倍以上の活性を示した。Iが効率良く基質を酸化しているのではないかと予想された。Iとチオアニソールとの反応の速度を比較した。Mbよりも2倍程度速く、2電子酸化活性が向上した要因の一つであると考えられる。MbとmCPBAとの反応後のタンパクの分子量は29-32Da増加しており、タンパク質が修飾されていることが明らかとなった。この分子量の増加は導入したトリプトファンの修飾によるものと推定された。Mbの修飾部位を決定するためにリシルエンドペプチダーゼ(Lys-C)で分解し、FPLCによりペプチド断片を分離、分取した後、質量分析によりフラグメントの分子量を確認した。その結果、Trp-43のみ30Da分子量が増加していることが判明した。この分子量の増加はトリプトファンに酸素原子が2つ挿入され、水素原子が2つ抜けたものと説明できる。触媒するヘム酵素である。一つの例として、P450camは基質であるcamphorをヘム近傍に水素結合により固定していることが結晶構造から明らかとなっている(図3A)。酸化反応は進行しなかったが、基質をヘム近傍に固定化することでP450に見られる基質の酸化反応が進行するのではないかと仮定した。Mbは、導入したトリプトファンがヘム近傍に固定されていることからこの仮定を検証するための良いモデルである(図3B)。(図3(A)、(B)省略)mCPBAとの反応により得られた、修飾型トリプトファンを含むペプチドフラグメントを大量に精製し、NMRによりその構造を同定した。その結果、生成物はトリプトファンに酸素原子が2つ挿入され、水素原子が2つ引き抜かれたtryptophan-2,6-dioneであることが判明した。よる6,7位のエポキシ化であると考えられる。その後溶媒のH<SUB>2</SUB>Oにより加水分解され6-hydroxyindoleが生成した後、さらに4電子酸化されtryptophan-2,6-dioneが生成したのではないかと推定した(スキーム1)。(スキーム1省略)トリプトファンをヘム近傍に固定化したことにより、Mb変異体において芳香環への酸素原子添加反応が達成された。この結果は、ヘム近傍における基質の固定化が芳香環の酸化のために重要な要素であることを示している。「第三部」カタラーゼはチロシンを軸配位子とした5配位高スピン型構造を持ち、過酸化水素の不均化反応を触媒するヘム酵素である。Mb二重変異体を作成した(図4)。近位ヒスチジンをグリシンに変換することにより基質がヘムキャビティーに入り込むための十分な空間を与えることができると考えられる。Mbの近位側にはカタラーゼの遠位ヒスチジンとほぼ同じ位置に97番目のヒスチジンが存在していることから、97番目のヒスチジンが一般酸塩基触媒として機能することが期待される。チロシンの配位構造は、吸収スペクトル、電子スピン共鳴スペクトル、共鳴ラマンスペクトル測定により確認した。(図4省略)その結果、Mbで初めて安定なチロシン軸配位子を持つ5配位高スピン型構造を構築することに成功した。Mbは電子構造的に、カタラーゼに近い構造をしていることが確認された。Mbはカタラーゼ活性を全く示さなかった。従って、カタラーゼ活性の発現には軸配位子だけでなく別の要素が必要不可欠であると考えられる。