Rev.131017(本製品は研究用試薬です。近年、高齢者(女性)において加齢に伴い全血中のGPx活性が低下することが報告されています。スーパーオキサイドジスムターゼ(SOD)、カタラーゼとともに生体内において重要な抗酸化作用を担っていると考えられています。本キットはPagliaら1)により報告された測定法を応用したものです(左下図)。H2Oに還元する際に、還元型グルタチオン(GSH)が酸化型グルタチオン(GSSG)に酸化されます。(GR)の作用で再びGSHに還元されます。NADP+に変換されます。可変式マイクロピペット(20〜1000μL)、マルチチャネルピペット、340nmの吸光度変化を測定できるマイクロプレートリーダー又は分光光度計(出来れば温度制御可能なもの)グルタチオンペルオキシダーゼ標品につきましては、必要に応じて市販品をご利用ください。採血時には抗凝固剤としてEDTA、ヘパリン、クエン酸を利用可能です。凍結しないようご注意ください。全血1容量に対し蒸留水9容量を混合することで溶血させ、さらにアッセイバッファーで10倍希釈します。アッセイバッファーに混合後は直ちに測定してください。この測定では、主にグルタチオンペルオキシダーゼ-1(cGPx)を検出します。血漿中にはグルタチオンペルオキシダーゼ-3が存在しますが、cGPxレベルに比べ濃度が低いため、測定には殆ど影響ないと考えられます。本キットでは血漿中のグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx-3)も反応します。微量の溶血でも赤血球由来GPx-1の影響が出ることにご注意ください。組織中に血液が含まれていると、赤血球由来GPx-1の影響が出ることがあります。DTT又は2-MEを含むpH7.5のトリスバッファーにて行います。組織ホモジネートを遠心し上清を回収、直ちに氷冷します。ホモジネート遠心上清をアッセイバッファーにて10倍以上希釈してから測定します。測定結果の補正には、出発材料となる組織の湿重量や、ホモジネート中の蛋白濃度が用いられます。組織採取からホモジネート、測定までを当日中に実施することをお奨めします。組織ブロックまたは組織ホモジネートの状態で-70°Cにて凍結保存してください。cells/mLの細胞懸濁液を用意します。遠心上清を回収、直ちに氷冷します。測定結果の補正には、出発材料となる組織の湿重量や、ホモジネート中の蛋白濃度が用いられます。培養細胞中のグルタチオンペルオキシダーゼの量は、実験系により大きく異なります。予備実験を行い、測定レンジに収まることを確認してから実施することをお奨めします。採血時には抗凝固剤としてEDTA、ヘパリン、クエン酸を利用可能です。NaCl)にて2〜3回洗浄します。細胞ペレットの4倍容量の氷冷水にて可溶化し、直ちに氷冷します。mg/mLとなります。mg/mLとなります)。測定はサンプル調製後2〜3時間以内に実施してください。サンプルは-70°Cにて保存可能です。試薬を室温に戻します。希釈済みのサンプルまたはアッセイバッファー(ブランク)をマイクロプレートに50μL/well分注します。NADPH試薬を全てのウェルに50μL添加します。希釈済みのH2O2試薬を全てのウェルに50μL/well添加、混合します。1分待ってから340nmにおける吸光度を30秒間隔にて5分間計測します。サンプル及びブランクについて、吸光度変化率を算出します。サンプル中のグルタチオンペルオキシダーゼ活性(mU/mL)を算出します。通常は150μLです。