このように一部研究計画の修正はあるが、概ね解析予定をこなし、今後の検討への準備も整ってきており、さらに本研究への方法論的基盤固めも同時に完了させており、全体としては順調な進行状況と考えている。Activity平成27年度の検討では、ヒト脾臓由来フェリチン蛋白添加でヒト肝癌細胞株HegG2でHAMP遺伝子発現増加が認められたが、他の細胞株やフェリチン蛋白では明らかな変動を認めていない。ng/mLでの設定を用いているが、今後はさらに高濃度フェリチン添加での検討をしていく必要を考えている。現在フェリチン強制発現HEK293安定細胞株樹立が一部終了したところで、引き続き進行中の細胞株樹立を進め、さらに肝癌細胞株での安定株樹立も同時に進める。その上で、それらの細胞株が細胞外へとフェリチン蛋白を効率よく放出するか検討し、その定量・モニタリングを行える条件を検討する。これらの細胞でのフェリチン発現・放出が効率よく行かない場合には、大腸菌での発現・精製に加え、ヒト網内系由来細胞株での検討も必要になりうると考えている。フェリチン蛋白の肝細胞におけるHAMP遺伝子発現への関与に関しては、フェリチンH-およびL-subunitと肝細胞膜表面でのトランスフェリン受容体1(TfR1)や各種の遺伝性ヘモクロマトーシス責任分子の結合などに関しての分子生物学的解析が必要と考えている。既報でのフェリチンH-subunitとの結合を考え合わせると、TfR1強制発現細胞ではHAMP発現亢進が予想されるが、細胞膜表面上で生体鉄感知を行うとする仮説があるHFEやTfR2の機能解明も併せて行っていくため、我々が既に作成・所有しているHFE、TfR2発現ベクターの遺伝子導入により各種肝癌細胞株から安定強制発現株も樹立する。assay解析を加え、細胞外フェリチン濃度変化からヘプシジン発現変動に至る一連の動きの解明を目指す。vivoでの高フェリチン血症とHAMP遺伝子・ヘプシジン発現の経時的変動についても解析していく。Carryover申請した所要額1,400,000円に対して、必要物品を過不足なく購入した結果実際に使用したのが848,363円であり、残額551,637円となった。予定より少額の使用となった理由としては、研究で使用するフェリチン発現ベクター作成に関して、クローニングや遺伝子組み換え作業が既に所有していた物品を活用することで予想より非常に順調に成功したことが最も大きい。Budget本年度の残額551,637円は、平成28年度の研究継続のための物品費の一部として使用したい。PCR)などに必要な経費として使用することで、より詳細な解析が可能となると考えている。