トキソプラズマ感染が脳神経系に与える影響は不明であり、精神疾患の発症や行動異常に至るメカニズムも解明されていない。トキソプラズマ感染が宿主を個体レベルで改変・支配するのかという確証を得るため、我々は原虫感染マウスを用いた行動測定実験系を確立した。感染マウスの脳では、視床を含む間脳において広範囲に原虫が検出された。感染マウスでは、新奇環境における探索行動の抑制、記憶の固定能力の障害、天敵に対する逃避行動の抑制が確認された。ら研究成果は、中枢神経系に影響を与えるトキソプラズマ由来ブレインマニピュレーターの存在を強く示唆するものである。以上の研究背景から、「トキソプラズマは宿主脳内へ感染することで脳神経細胞を分子レベルで改変し、宿主を個体レベルで支配する」独自の寄生戦略を持つという考えに至った。以上の研究背景をもとに次の仮説を立てた。・トキソプラズマが広範囲の脳領域へ侵入し、脳神経細胞に潜伏する。・脳神経細胞内で、原虫から放出される分子により細胞が制御不能になる。情動行動に異常が起こる。本研究の目的は、トキソプラズマ由来ブレインマニピュレーターを同定し、原虫感染によりどのように脳神経細胞の機能が改変されるのかを解明することであり、以下の3つの研究課題を明らかにする。(1)脳神経細胞の網羅的トランスクリプトームにより、細胞の機能が変化している経路を推定する。(2)脳神経細胞の機能遺伝子の発現を制御する原虫因子の同定を行う。本研究では「宿主中枢神経系を支配するトキソプラズマ由来ブレインマニピュレーター」の同定により、脳神経細胞の機能が改変されるメカニズムの解明を目指し、以下の研究課題を実施した。vitroで誘導し、トキソプラズマのタキゾイト(PLK株)を感染させた。感染後20時間で細胞を回収し、RNAを抽出した。IIx)を用いたRNA-seq法によるトランスクリプトーム解析を行った。得られたデータはDEseqにより統計解析し、感染により発現変動が認められた遺伝子を抽出した。ontology解析により変化が推測される経路を解析した。野生型マウスとTLR2欠損マウスのデータを比較解析し、TLR2依存的な発現変動を示す遺伝子群の解析を行った。Promoter(応答エレメント)の制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現するベクターを用い、293T細胞にトランスフェクションすることでルシフェラーゼ発現を測定するアッセイ系を構築した。Promoterと対応するシグナル経路を表1に示す。トキソプラズマ由来分子として細胞小器官から分泌されるタンパク質に着目し、デンスグラニュルから放出されるタンパク質群18種およびロプトリーから放出されるタンパク質群21種についてcDNAをクローニングし、哺乳動物発現用ベクターに挿入した。上記ルシフェラーゼ遺伝子を発現するベクターと原虫cDNAを293T細胞へ導入し、ルシフェラーゼの発光シグナルのレベルが変化する原虫因子をスクリーニングした。(3)原虫因子の遺伝子改変原虫の作製スクリーニングした原虫因子(TgGRAI、TgCyp)について、CRISPR/CAS9法をもとにした以下の方法により当該遺伝子を欠損させたトキソプラズマを作製した。トキソプラズマ用ベクターpSAG1::CAS9-U6::sgUPRTを用いて標的遺伝子のゲノム配列よりガイドRNAを組み込んだ遺伝子欠損用プラスミドを作製した。ピリメタミンで薬剤選択可能な耐性遺伝子DHFR-TS発現カセットを調整し、遺伝子欠損用プラスミドと共にトキソプラズマ株PruHXGPRT(-)Ku80(-)株へ導入した。ピリメタミンで薬剤選択し、生存したクローンについて遺伝子レベルおよびタンパク質レベルでの対象遺伝子の欠損を確認した。性状解析を行い、遺伝子欠損による一般的な感染性に与える影響を確認した。vivo実験系の構築と候補原虫因子の評価トキソプラズマ急性感染モデルにて、うつ様症状の発現の評価を行った。具体的には、正常マウスと比較して、スクロース嗜好試験ではスクロース嗜好性が低下すること、強制水泳試験では水中での静止時間が増加することを指標に解析した。免疫抑制剤デキサメタゾンの投与によりトキソプラズマの再活性化を誘導し、上記のうつ様症状の発現の評価を行った。感染急性期(感染後10日)、慢性期(感染後30日)、再活性化期(感染後60日)の脳組織を採材し、リアルタイムPCRによる遺伝子発現の変化、高速液体クロマトグラフィーを用いた神経伝達物質の測定を行った。トキソプラズマ慢性感染モデルでは、恐怖条件付け試験を指標とした行動実験でマウスの恐怖記憶の固定を評価した。感染37-41日めのマウスを測定用チャンバーに入れ、音による刺激の後電子刺激による条件付けを行った。翌日、マウスを同じ測定用チャンバーに入れ、すくみ反応時間を計測した(文脈試験)。その翌日には、マウスを条件付けに使用したものとは異なるチャンバーに入れ、条件付けと同じ音刺激を与えた時のすくみ反応時間を計測した(音試験)。恐怖記憶が正常であれば、文脈試験と音試験でマウスはすくみ反応を示す。次に記憶の消去を評価するため、条件付けと同じ音刺激を30回連続で与え、すくみ反応時間を計測した。記憶の消去能力が正常であれば、マウスのすくみ反応時間はしだいに減少していく。(3)で作製した遺伝子欠損原虫株は、それら感染マウスに対し恐怖条件付け試験を行った。4.研究成果(1)脳神経細胞の網羅的トランスクリプトームTLR2はTLRファミリーに属する受容体タンパク質で、トキソプラズマに対する防御免疫の作動に不可欠であることが知られている。神経炎症等に関連し、中枢神経系におけるその病理学的な機能の研究も進みつつある。そこで、トキソプラズマ感染時、脳細胞でTLR2が担う機能の解明を目指し、TLR2欠損マウスを用いたトランスクリプトーム解析を行った。TLR2依存的に発現上昇する遺伝子として、Asでは免疫・ストレス応答関連遺伝子が上位を占めた。Neuでは代謝関連遺伝子のTLR2依存的な発現上昇が認められた。Neuでは代謝関連遺伝子が認められた。本解析により、脳神経細胞におけるTLR2依存的な機能として、原虫排除に必要な脳内免疫の活性化の重要性が示された(2)脳神経細胞の機能遺伝子の発現を制御する原虫因子の同定トキソプラズマのデンスグラニュルから放出されるタンパク質群18種およびロプトリーから放出されるタンパク質群21種について、宿主細胞のシグナル伝達の活性化に与える影響を解析したところ、候補分子として2種(TgGRAI、TgCyp)を見出した(表1)TgGRAIはカルシウム/カルシニウリン及びNFkBのシグナルを活性化することが示唆された。これらシグナルは神経細胞やグリア細胞の機能及び神経炎症に関与することが知られており、TgGRAIが脳神経細胞に影響を与えることが推測された。TgCypは小胞体ストレスのシグナルを活性化することが示された。小胞体ストレスは、小胞体内のカルシウム枯渇、細胞への酸化ストレス、変異タンパク質の発現、低グルコース状態や低酸素状態など、様々な生理的ストレスによって生じることが知られている。従って、トキソプラズマ感染も細胞に対してストレス応答を誘導するため、感染による脳病態へのTgCypの関与が示唆された。(3)原虫因子の遺伝子改変原虫の作製スクリーニングした原虫因子(TgGRAI、TgCyp)について、CRISPR/CAS9法をもとに当該遺伝子を欠損させたトキソプラズマを作製した。性状解析を行い、親株原虫と比較して遺伝子欠損原虫の上記性状に変化は認められなかった。vivo実験系の構築と候補原虫因子の評価トキソプラズマ感染マウスモデルにて、うつ様症状の発現の評価を行った。トキソプラズマ感染急性期および再活性化期にはマウスにうつ様症状が発現することが明らかとなった。この病態には、インターフェロンガンマによる炎症反応、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼによるキヌレニンの産生が関与しており、それぞれの阻害剤投与によるうつ様症状の改善が確認された。うつ様症状の発現には神経伝達物質のドーパミン、セロトニンの関与は明らかでなかったことから、本病態には感染による炎症反応により生じるキヌレニンが重要であることが示唆された。慢性感染期にはマウスの恐怖記憶が障害されることが明らかとなった。これらマウスでは恐怖記憶の形成に重要な脳領域である大脳皮質と扁桃体に障害が認められた。感染により大脳皮質ではドーパミン代謝の亢進とノルエピネフリンの低下、扁桃体ではノルエピネフリンとセロトニンの低下が認められた。これら神経伝達物質は恐怖記憶の形成に必要であり、トキソプラズマの脳内感染により脳機能の傷害が起きていることが示唆された。記憶の消去能力においては、感染マウスでも正常であった。上記実験をトキソプラズマの近縁原虫であるネオスポラの感染で実施したが、ネオスポラの感染ではマウスの恐怖記憶の障害は認められなかった。従って、マウスの恐怖記憶の障害はトキソプラズマ感染に特有な生体反応であることが示唆された。(3)で作製したTgGRAI欠損株とTgCyp欠損株を用いてマウスの感染実験を行った。親株原虫Pruの感染と比較して、TgCyp欠損株感染マウスの感染後30日の生存率に有意差は認められなかった(共に生存率90%)。TgGRAI欠損株感染マウスでは4割のマウスが感染12日までに死亡した。次に、上記実験で生存したマウスについて感染40日から恐怖条件付け試験を行った。文脈試験では親株原虫Pru感染マウスとTgCyp欠損株感染マウスにてすくみ反応の低下が認められたが、TgGRAI欠損株感染マウスの7割が非感染マウスと同レベルのすくみ反応を示した。音試験では、親株原虫Pru感染マウス、TgCyp欠損株感染マウス、TgGRAI欠損株感染マウスですくみ反応の増加は認められなかった。以上のことから、TgGRAI欠損株感染マウスは視覚からの恐怖記憶が回復していることが示唆され、本反応におけるTgGRAIの関与が推測された。今回の結果は、脳機能に影響を与えるトキソプラズマ分子の存在を示唆しており、今後はより詳細な分子メカニズムの解明が必要とされる。gondii)【猫による被害まとめ】1.糞尿・スプレーによる悪臭。2.駐車中の車への傷つけ・スプレー。3.悪戯・喧嘩による庭の破壊。4.ペットへの加害・捕食。6.ゴミ漁りによる散らかし。7.蚤・トキソプラズマ等の、寄生虫・菌・ウィルスの感染媒体となり人に感染、若しくは中継。※公園で野良猫に餌やりをされた為に野良猫が集まり、砂場が猫のトイレと化し子供達が遊べなくなるケースも発生しています。猫狂「猫嫌いはキチガイ。-------------------------------------------------------猫様に奉仕するため社会と戦った、猫真理教の聖戦士たちを紹介します。「包丁を持った男が女性を追いかけている」と110番通報があった。女性は病院に搬送されたが、間もなく死亡。同署は殺人容疑に切り替えて捜査している。同署の調べによると、林容疑者は同日午後1時40分ごろ、隣に住む無職の女性(64)の腹部を包丁で2回刺して殺害した疑いが持たれている。林容疑者が2年ほど前から野良猫の餌付けをしていたことを巡り、女性とトラブルになっていた。同署の調べに林容疑者は「猫のことで注意され頭にきてやった」と供述しているという。懲役22年(求刑懲役25年)の有罪判決を言い渡した。判決などによると、昨年6月5日午後、高田被告は前日に大家の妻から猫に餌をやらないよう注意されたことに不満を持って自室で騒ぎ、注意しに来た大家の首をナイフで刺すなどして失血死させた。大家の長男の妻の顔をバールで殴って2カ月のけがを負わせた。(70)を殺人未遂容疑で逮捕した。調べによると、中田容疑者は同日午後10時半ごろ、同じアパートに住む男性(54)の右胸を、自宅にあった包丁で刺した疑い。電車妨害の男逮捕8日午後3時10分ごろ、大阪府貝塚市のJR阪和線和泉橋本-東貝塚間で、線路に自転車の車輪や石などがあるのを白浜発新大阪行き特急「くろしお16号」の運転士が発見緊急停車した。運転士が線路脇に除き、約5分後に運転を再開。