Achievements1)平成30年度成果の具体的内容これまでに我々が樹立した786-O/TR-pVHL細胞におけるpVHL発現レベルと誘導効率をウエスタンブロットで検証した。ドキシサイクリン添加により効率よくpVHLの発現が誘導され、未添加の状態では長時間露出でわずかにpVHLの発現を認める程度であった。低酸素応答エレメントを組み込んだルシフェラーゼコンストラクトを用い、pVHLの発現誘導によるHIFαの分解機能を評価した。親株とTetRのみ発現する786O細胞では高い低酸素応答エレメントに対する転写活性を示したが、786-O/TR-pVHL細胞ではドキシサイクリン添加の有無に関わらずHIFαの転写活性が抑制されており、ごくわずかのpVHLによりHIFαが分解されている事が明らかになった。nullの786-O細胞と、786-O細胞にVHLを安定発現させたWT8細胞を用いて3次元培養実験系を構築中である。HK2でVHL欠損株を作成した。2)本成果の意義、重要性786-O細胞系およびHK2細胞株の双方で、pVHL発現の有無によるトランスクリプトーム解析、プロテオミクス解析を実行することにより、VBC-Cul2複合体の新規標的分子をより精度高く同定することが期待される。planned.Reason786-O/TR-pVHL細胞を用いて実験を開始したが、当初予想された3次元培養でのsphere形成能に有意な差異を認めなかった。pVHLの発現とHIFαの転写活性を検証したところ、ドキシサイクリン未添加でのごくわずかのpVHL発現でもHIFαの転写活性が抑制されている事が明らかになった。一方で並行して進めていたバックアップの系で、HK2細胞におけるVHL遺伝子のノックアウトに成功するとともに、発現誘導の系ではない786-OとWT8の系で3次元培養を検討中である。Activity引き続き786-O/TR-pVHL発現誘導系の再確立を目指すが、上手くいかない場合の救済実験系として誘導発現系ではないが、786-Oを親株としpVHLを安定発現しているWT8を用いて、3次元培養における検討を継続する。腎細胞癌の発生由来は近位尿細管細胞とされており、近位尿細管におけるVHL欠損が発癌の初期イベントと考えられているため、ヒト近位尿細管細胞株HK2を用いてCRISPR/Cas9によりVHL遺伝子をノックアウトする系を確立した。これら2ないし3の実験系を用いて、当初計画していた3次元培養ならびにオミクス解析を行っていく予定である。