制限酵素によるDNAの消化切断DNAを制限酵素を消化します。この際、消化断片の末端は粘着末端(突出末端)および平滑末端でも正しく保存されます(ライゲーションの際にタイプと配列の相補性が判定されます)。試薬・装置1.ゲノム断片塩基配列ファイル(*、**):例(Bsub_50kb.gbk)2.実行ソフトウェア:IMCSE/GE/AE*DNA塩基配列は、Genbank、EMBLなどのサイトからダウンロード可能です。**例はインストール時のサンプルに含まれています。isb/imc/samples方法1.塩基配列ファイル読み込みボタンをクリックし、ファイル選択ダイアログから鋳型DNA塩基配列(例の場合はBsub_50kb.gbk)をIMCに読み込みます。2.IMCメイン画面左側の反応チューブに円形あるいは線形のDNAアイコンが表示されます。3.ズームアウトボタンを何回かクリックすると以下と同様のマップが見えてきます。4.制限酵素反応ボタンをクリックします。5.すると右のような、制限酵素反応ダイアログが表示されます。このダイアログでは登録されている制限酵素リストから、目的の制限酵素を選択し、1で読み込んだ塩基配列を消化切断する酵素を探します。6.最初にリストアップされているのは、現在登録されている全制限酵素です。ダイアログ上部の各チェックボックスやラジオボタンにチェックやオン・オフ操作を行うことにより、対象とする制限酵素を絞り込むことができます。7.Typeでは4bp、6bp、8bp、othersとあり、それぞれにチェックすると、たとえば、4bpにチェックを入れると、4塩基認識制限酵素のみがリストに表示されます。Palindromicにチェックをいれると回文構造をもつ制限酵素のみがリストアップされます。結果から制限酵素を絞り込むことも可能です。Enzymeをオンにすることにより、1の塩基配列中の制限酵素認識サイトがある数の範囲にあるものだけをリストアップすることが可能です。Allボタンをクリックしてチェックマークをリスト中の全制限酵素に付加しておく必要があります。9.塩基配列の特定の領域だけから制限酵素を探索することも可能です。Toに塩基配列の範囲を指定します。この範囲だけから探索されます。10.それでは、実際に制限酵素反応を実験してみましょう。11.サンプルの塩基配列Bsub_50kb.gbkを2箇所から5箇所まで認識する制限酵素を見つけるには次のようにします。Enzymeをオンにします。toに2と5をそれぞれ入力します。Allボタンをクリックします。Sitesボタンをクリックします。12.するとサンプル塩基配列の地図上(赤)および塩基配列上(青)に制限酵素認識部位の表示が行われます。13.同時に、制限酵素別の認識部位数のリストウィンドウが表示されます。14.このリスト中から使いたい制限酵素を選択します。選択は複数指定可能です。今回は、制限酵素SalIにチェックを入れます。すろと、ウィンドウの右のリストにサンプル塩基配列中のSalI認識部位のリストが表示されます。ここには実際の認識配列が表示されます。AvaIなどのあいまい塩基配列を認識する制限酵素でも、実際の配列が表示されますので、ここの塩基配列に認識部位ごとに異なる場合があります。Featureボタンをクリックします。すると、Bub_50kb.gbkのフィーチャーマップ上の対応する位置に制限酵素のフィーチャーが表示されます。ここでは一度に10000箇所以上のフィーチャーを登録しても構いません。16.実際にフィーチャーとして登録された制限酵素認識部位は右図のようになります。17.次に、実際にBsub_50kbを制限酵素で消化切断します。この場合は、SalIのすべての認識サイト5箇所にチェックいれて、Window下部のDigestionボタンをクリックします。18.すると、Bsub_50kb.gbkのSalI消化断片のリストが表示されます。Bsub_50kb.gbkは枯草菌ゲノム塩基配列の一部ですが、circularのアノテーションを残しているため、環状DNAとみなされます。5箇所の場合は5個の消化断片が生成されます。線状DNAであれば、この場合6個の断片が生成されます。Busb_50kbL.gbkで試してください。19.制限酵素断片リストにチェックマークをつけて、Loadボタンをクリックすると、それらの断片が反応チューブにLoadされ、マップが表示され、フィーチャー操作が可能となります。Artisteer.。