PC021PCR産物のA塩基の突出末端の生成を利用して、T-Vectorとともにクローニングを行います。以下のインシリコ実験には、IMCを使用します。SE/GE/AE*塩基配列は、インシリコバイオロジー社のサイトからダウンロード可能です**制限酵素はIMCに標準で登録されているものが使用できます***例はIMCのサンプルファイルに入っていますインシリコ実験方法まず、T-ベクターを作成します。環状のベクター塩基配列(pColdII.gbk)をIMCに読み込みます。制限酵素ボタンをクリックします。制限酵素(EcoRV)にチェックをつけます。Site」ボタンをクリックし、EcoRVの認識部位を確認します。EcoRVの認識サイトが1箇所だけ確認されたので、そのまま「Digestion」を実行します。その結果直鎖状となったDNAアイコンをクリックして、その末端を調べます。平滑末端であることがわかります。この平滑末端の3’側にT塩基を1塩基分付加します。このためには、「T塩基付加ボタン」をクリックします。両末端の形状を調べます。両端の3’側にTが1塩基付加されていることがわかります。これで、T-Vectorが作成されました。次に、ゲノムDNAの一部領域をPCRで増幅します。枯草菌由来のゲノムDNA(Bsub_50kb.gbk)(人工的に環状にしたもの)をIMCに読み込みます。上記のゲノムフィーチャーマップの任意の領域をマウスでドラッグします。ドラッグ範囲がカラー(ピンク)で表示されます。このカラー化された領域でマウスを右クリックします。Design」を選びます。Design」ダイアログが表示されます。デフォールトのまま何も指定しないで、ダイアログ下部の「Set」ボタンをクリックします。List」ダイアログが表示されます。(最適なプライマーがない場合はプライマーが見つからないとのメッセージが表示される場合がありますので、PCRの条件を変えて再実行します)。ends」というチェックボックスがあるので、チェックを入れます。(チェックなしに実行すると、平滑末端のPCR産物が生成されてしまいます)。リストの上位のプライマーセット1つにチェックをつけ、「Amplify」ボタンをクリックします。Sitesが検出されます。生成されたPCR産物をLOADし、そのアイコンをクリックします。両端の形状を調べます。ライゲーションボタンをクリックします。直鎖状化され、T塩基を付加したベクターと、PCRで増幅された産物をライゲーションします。2つのファイルを選択し、「Legation」ボタンをクリックします。2つの産物が表示されるので、2つともチェックし、LOADします。それらの産物のアイコンが環状であることを確認し、1つ1つクリックして、フィーチャーマップを表示します。Map」ボタンをクリックし、インサートされたPCR産物を選び、プラスミドマップを描画します。Artisteer.。