手技を身につけ、正しく操作することを目的とした。・スラント、棒状培地に使うPDA培地と液状培地に使う麦芽エキス培地を作った。mLを1L容三角フラスコに加え、アルミホイルでフタをし、湯煎して寒天を十分に溶かした。mL):45本に分柱した。スラントは斜めにして固めた。mL):12本に分柱した。salmonicolor・クリーンベンチのファンスイッチと照明スイッチをONにした。・衣類の袖をまくり、手と腕をオスバン液に浸した布で拭いた。・試験管のガラス部や白金耳の柄の部分をオスバン液で浸した布で拭いてもらい、クリーンベンチで入れてもらった。・白金耳などのニクロム線部分を火炎で熱し、冷ましてから菌を接種した。・作業が終了したらファンスイッチをOFFにした。クリーンベンチ内を殺菌した。・寒天培地を100°Cのお湯で溶解した。・溶けた寒天培地を55°Cの湯煎に入れ、この温度に保った。3本をクリーンベンチ内に入れた。・種菌から1白金耳とり、滅菌水に浸し、攪拌した(第一希釈液)・溶けた寒天培地を2本クリーンベンチ内に入れた。・第一希釈液より1白金耳とり(白金耳は一回ごとに変えた)第一の培地に懸濁した(第2希釈)※両手の手のひらに試験管を挟んで錐もみすると泡立たなかった。・これより1白金耳とり、第2の培地に懸濁した。(第3希釈液)・第1、第2の培地をそれぞれシャーレに流し込みフタをした。・素早く寒天培地を均一に広げた。・寒天が凝固したらクリーンベンチから取り出し、倒置して30°Cのインキュベーターで培養した。※素早く操作しないと途中で寒天が固まり失敗した。・同大のシャーレ(フタとフタ、実と実)を合わせ一人一つ乾熱滅菌し、それぞれに寒天培地を流し込んだ。・第1のシャーレに種菌(スラント)から1白金耳をとり、字を書くように接種した。・2つのシャーレを合わせ、テープで止め、30°Cで培養した。(第1シャーレが上)放出された胞子は第2のシャーレ上に落ち、増殖してコロニーを形成した。・saccharomycesも同様に班で2つ行った。・希釈度の低い方がコロニーが大きかった。濃度の違う2つの菌液ではコロニーの大きさと数に大きな違いが生じた。その理由として、濃度が大きい方がより多くの菌を有するため、大きさが大きくなり、数も多くなると考えた。レポート課題として平板注加培養で凝固した寒天を倒置するのはなぜかという問いがあった。これは寒天が下にあると上の蓋の水滴が寒天に落ちるのは防ぐためだと考えられる。・白金鈎を使用し、胞子のみをとった。・胞子を着生していないものは菌糸をごく少量かきとった。・白金鈎で種菌から胞子をとり、液体培地に接種した。・30°Cで静置培養と振とう培養を行った。・PDA培地の斜面培地に種菌から白金鈎で接種した。mmとなるように注いだ。mm平方の寒天フィルムを切り出した。・滅菌したスライドグラスへ寒天フィルムをのせた。・寒天フィルムの側面(4面)に胞子をつけた。・滅菌したカバーガラスをのせた。・3方ワセリンで封じた。・シャーレの中に水を湿らせたろ紙をひき、その上にマッチ棒を枕にしてスライドグラスを置く。・シャーレの蓋をして30°Cで培養した。・スライドグラスを顕微鏡にのせ10~100倍で観察した。『考察2』カビの培養はコンタミしないように気を付けた甲斐あって、想定通りの結果が得られた。今回使ったカビはどういうことに使われているのかという課題について下記に示す。A.oryzaeは米、麦、大豆などの穀物の発酵に利用される。A.luchuensisは酒の製造過程で利用される。P.chrysogenumはチーズの製造に用いられる。R.javanicus,M.javanicusは紹興酒などの酒の製造に用いられる。M.ankaは紅酒や豆腐などの発酵食品に利用されている。mL容三角フラスコに入れ、液面に印をつけた。・それぞれの三角フラスコに脱イオン水を印を付けたところまで加え、50°Cほどのお湯で完全に溶解させた。・三角フラスコにシリコ栓をし、100°C、30分間で3回の間欠滅菌を行った。・クリーンベンチ内でスキムミルク培地にそれぞれ乳酸飲料(ジョア)を1本ずつ加えた。mL容ビーカーに分柱した。mLスキムミルク培地と乳酸飲料の混合液と上記のビーカーを37°Cでインキュベートした。試料:市販の乳酸菌含有飲料(班で数種類試験した)・シャーレの実皿をフタ皿の上に重ねて乾熱滅菌した。mL)をフタ皿に注いだ。・寒天が凝固しないうちに実皿の底部をこの上に押し込み37°Cで1~2日培養した。mLをシャーレに流し込んで固めた。cmの高さから落とすように置いて少し寒天内に突き入らせて立てた。コロニーは検出されなかった。)1040XY1つ目直径(mm)111614122つ目直径(mm)91614133つ目直径(mm)121717134つ目直径(mm)8161413この結果から、y=0.0175x+0.925という式が出せた。y=7.143よって、xの濃度は31.429ɤ、yの濃度は7.143ɤとなった。今回使用したxとyの実際の値はそれぞれ30ɤ、20ɤである。xはおおよそ近い値がとれているが、yは大幅にずれている。この原因はいろいろ考えられるが、私は菌接種時と抗生物質の滴下時にコンタミネーションが起こってしまったと考える。炭酸カルシウム含有MRS寒天培地グルタミン酸含有MRS液体培地<1日目>・持参した分離源をMRS液体培地に接種し、30°C嫌気条件下で培養した。<2日目>・培地が濁っているのが確認出来たら、培養液を1白金耳とり、炭酸カルシウム含有MRS寒天培地に塗布し、30°C嫌気条件下で培養した。<3日目>・培養しておいた炭酸カルシウム含有MRS寒天培地を観察し、周囲にクリアゾーンができているコロニーを選択した。・選択したコロニーを釣菌し、新しいMRS寒天培地2枚に植菌し、最後にグルタミン酸含有MRS液体培地に接種した。・2枚のMRS寒天培地はナンバリングシートを張っているので、各自、同じ番号の箇所に植菌した。・寒天培地は1~2日間培養、グルタミン酸含有MRS培地は3~4日間培養した。<4日目>・植菌した2枚の寒天培地のうち、1枚は保存用で、もう1枚はカタラーゼ試験用にした。・コロニー上に過酸化水素水を滴下し、様子を観察した。μlを別のマイクロチューブに採取した。・このサンプルについて、TLCにより、GABA生産の有無を確認した。・TLCは2班で1つ使用した。・また、その際に、下記に示すコントロールもスポットした。・展開後、乾燥させニンヒドリンによって、発色させた。私が採取した試料からとれたコロニーは過酸化水素水をかけると発泡した。私の採取した試料のコロニーが発泡したことから、この資料には乳酸菌が含まれていないことが分かった。TLCの結果を見ると全員が大体求めていた結果が表れていたので、過程がしっかりできていたと思った。subtilisはブイヨン斜面培地に接種し、37°Cで培養を行った。lactisはMRS高層培地に接種し、30°Cで穿刺培養を行った。・スライドガラスに滅菌水を1滴滴下した。・白金耳または白金線で菌を懸濁した。・カバーグラスに滅菌水を1滴滴下し、反転させてカバーをした。・カバーグラスの上にセダー油を滴下し、検鏡した。※油浸用の対物レンズを使用した。※セダー油は1滴とし、あまり多量滴しなかった。※使用後は直ちに、レンズクリーニング用のペーパーでレンズに付着したセダー油をふき取った。subtilis(グラム陽性)を同一スライドグラス上に塗布して行った。・ポイントはスライドグラス上に菌体を少なめに薄くかつ、広くひろげることと各染色液の水洗を静かに行ったことである。・乗法通り塗布、風乾、固定した。・クリスタルバイオレットで1~2分間染色した後、十分傾斜した。・直ちに水洗後水を切った。・ルゴール液に1分間浸した。・95%アルコールの中でゆっくり動かし脱色した。この時間が長いとグラム陽性菌も脱色されてしまうので注意した。カバーグラスに1滴滅菌水を滴下し、かぶせて検鏡した。subtilisのそれぞれに対してグラム染色を行った。その後、E.coliとB.subtilisを混ぜてグラム染色を行い、染め分けができているか確認した(グラム陽性菌は青色、グラム陰性菌は赤色に染まる)。lactisについて、グラム染色を行い、陰性か陽性かを決定した。い毛のようなものが飛び出ていた。『考察5』グラム染色の際、私たちの班は想定のものが観察できるまで同じ操作を何度も繰り返した。この理由は最初の方の染色時に火炎固定が十分にできておらず、液が流れてしまったと考えられる。・感染力を持つファージの数を測定するため、寒天重層法によるプラークカウントを行った。・ファージを多量の感受性菌とともに寒天平板培地上に塗布すると、菌の増殖によって平板は一様に濁るが、ファージが存在した箇所のみ溶菌し、透明な部分(プラーク)が現れた。・このプラークを数えることにより、活性ファージの数を知ることができた。・1枚の平板で数えうるプラークの数は、プラークの大きさによって異なるが、100~1000が適当であった。・したがって、ファージ液は適当に希釈して、数段階の希釈液についてプラークカウントを行う必要があった。菌の濃度はOD660=0.3前後が適当であった。mLの希釈液に加え混和した(100倍希釈)。mL加え混和した(10倍希釈)。10倍希釈を3回行った。mLずつ分柱し、55°Cに保った。実験は希釈倍率の高いものから行った。・倒置せずに37°Cで一晩培養した。・プラークをよく観察し、計数した。(ファージによってプラークの様子は異なった)・ファージ感染菌は潜伏期後溶菌を起こした。その経過を分光光度計を用いて追跡すると、溶菌は比濁度の減少として表れた。mLを滅菌済みL字管に入れる。OD660が0.1付近になるように比濁度のコントロールにはブイヨン液体培地を用いた。mLを2本のL字管に加え、モノー振とう器を使い37°Cで培養した。・ファージを加えたときを0分として、10~15分毎にOD660を測定し、その経過をグラフ用紙に記入した。(測定時間はファージの種類で異なった)ファージ感染菌は潜伏期後溶菌を起こした。その経過を分光光度計を用いて追跡すると溶菌は比濁度の減少として表れた。OD660が0.1付近になるように比濁度のコントロールにはブイヨン液体培地を用いた。mL、100倍希釈ファージ液を2本の試験管に加えモノー振とう器を使い37°Cで培養した。3.ファージを加えたときを0分として、10~15分毎にOD660を測定し、その経過をグラフ用紙に記入した。溶菌実験で使うファージ液の量の計算106希釈の液を用いて行い、0.1ml中に平均34個のコロニーが検出されたため、以下の結果になった。340×106個/mlここでmoi値は0.5、バクテリアは2.0×108個/mlであるから、340×106×x/2.0×108×5=0.5ゆえに、x=1.47必要なファージ液の量は1.47mL『考察6』このグラフからファージ液を培養液に加えたものが時間の経過とともに比濁度が下がていることが読み取れる。これはファージが菌を捕らえているためである。比濁度が最小値まで下がると今度は徐々に上がるようになる。これは培養液内の菌がファージに対する耐性菌を生成するためである。実験手順】1)マイクロチューブを2本とり、それぞれ(λ)、(P)の印をつけた後チューブ縦にたてた。2)P-200を用いてそれぞれのチューブにH2Oを28μl分柱した。μL採りそれぞれのチューブに加えた。4)λファージDNA(赤丸チューブ)をp-20で15μL採り(λ)のチューブに加え、指で軽くはじいて溶液を攪拌した。5)pUC19DNA(黄丸チューブ)をp-20で15μL採り、(P)のチューブに加え、指で軽くはじいて溶液を攪拌した。μLt採りそれぞれのチューブに入れ、指で軽くはじいて溶液を攪拌した。7)それぞれのチューブは37°Cに設定されたドライブロックに突き刺し、10分加温した。8)それぞれのチューブにH2Oをp-200を使って300μL(150μLを2回)加えた。それぞれのチューブに加えた。フェノールクロロホルムイソアミルアルコールは皮膚につくと重度のやけどをおこすので、取り扱いには十分に注意した。10)チューブに蓋をした後、指に挟んで固定し反転させながら攪拌した。11)フェノール処理後、チューブを高速遠心機にかけ12000rpm、5分間遠心した。12)遠心後、チューブ内にはDNAを含む水層(上層)とフェノール層(下層)の二層に分かれた状態になった。設定し、フェノール層をとらないように水層をとった。それぞれのチューブでチップは取り換えた。15)チューブに蓋をした後、指に挟んで固定し反転させながら攪拌した。16)攪拌後、チューブを高速遠心機にかけ12000rpm、5分間遠心した。17)遠心後、チューブ内にはDNAを含む水層(上層)とクロロホルム層(下層)の二層に分かれた状態になった。次に、p-200を使い、150μLに設定して注意深く上層のDNA溶液を採った。CH3COONaをDNA溶液に加えた。チューブに蓋をした後、指に挟んで固定し反転させながら攪拌した。それぞれのチューブを氷の上に立てて10分放置した。20)チューブを手で握って氷結した試料を溶解させた後、高速遠心機にかけ12000rpm、10分間遠心した。遠心後、卵を割るようにしてチューブの蓋を開け、上清を完全に流して捨てた。加えた後、チューブを指に挟んで固定し反転させながら攪拌した。22)チューブを高速遠心機にかけ12000rpm、10分間遠心した。上清を上記のようにして、完全に取り除いた後、沈殿(目に見えない)をチューブをペーパーにひっくり返して乾燥させた。実験手順】1)マイクロチューブを1本チューブ立てにとった。2)P-200を使って、H2Oを23μLチューブに入れた。4)連結酵素用10倍濃縮緩衝液を5μLチューブに加えた。5)T4リガーゼをP-20を使って2μLチューブに加えた。6)4°Cで一昼夜放置した。実験手順】1)-80°Cに凍結保存した50μLコンピテントセルを融解後、氷水中に置いた。2)DNA溶液を2μL加え、0°Cで5分間静置した。3)静置後、直ちに42°C、45秒間熱処理した。4)再び、0°Cで1分放置した。5)LB寒天培地にX-galを60μL、IPTGを30μL滴下した。6)形質転換菌液を全量滴下し、プレート前面に広げ、37°Cで一晩培養した。7)出現した白色コロニーは、滅菌した爪楊枝等でアンピシリンを含むLB液体培地に接種した。実験手順】1)p-1000を用いてチューブに菌液を採った。軽く遠心した後、チューブの蓋を卵を割るようにして開け、上清をシャーレに流しだして捨てた。2)p-200を用いて100μlのリゾチーム溶液を加えた後、チューブをミキサーにかけ菌体を混濁させた。3)蓋を開け、チューブ立てに差し込んで室温に5分間放置した。4)p-1000を用いて200μlのアルカリ-SDS溶液を加え、蓋をしたチューブを縦に持ち、ゆっくり5回反転させて液を混ぜた。0°C5分間放置した。5)p-200を用いて予め冷却しておいた酢酸カリウムをすばやく150μL加え蓋をした後、チューブを縦に持ち持った手を5回たたいて液を急激に攪拌させた。攪拌後チューブを氷中に5分間放置した。6)チューブを遠心分離器にかけ、12000rpm、5分間遠心した。この間に新しいチューブを用意しておいた。7)遠心後、p-200を用いて注意深く上清を採り、新しいチューブに移した。8)p-1000を用いてフェノール・クロロホルムを300μl加えた。チューブを縦に持ち、反転させながら攪拌後、2分間遠心した。遠心後、p-200を使って上清を300μl注意深く新しいチューブに採った。9)もう1回クロロホルムをp-1000を用いて300μl採り、5分間遠心後、上清を採った。10)上清にp-1000を用いて95%エタノールを400μl加え、チューブを反転させて液を攪拌させた後、室温に2分間放置した。次に、チューブを12000rpm、10分間遠心してDNAをペレットにした。遠心後、卵を割るようにしてチューブの蓋を開け、エタノールをシャーレに流しだした。次に、p-1000を用いて70%エタノールをチューブに加え蓋をして上下反転させて攪拌した。上記のように遠心したのち、エタノールを流しだし、チューブをペーパータオルの上に逆さまにして5分間程放置した。その後、乾燥させ、p-200を使って20μlの脱イオン水を加え、プラスミドを溶解させた。実験手順】1)マイクロチューブをとり、チューブ立てに立てた。2)P-200を用いてチューブにH2Oを28μl分柱した。3)P-20を用いて、HindIII用10倍濃縮緩衝液を青丸チューブから5μl採りチューブに加えた。4)プラスミドDNAをp-20で15μl採りチューブに加え、指で軽くはじいて溶液を攪拌した。5)制限酵素HindIIIをp-20で2μl採りチューブに入れ、指で軽くはじいて溶液を攪拌した。