FavoritesSummaryこのプロトコルは、FRETに基づく近接アッセイを使用してどのようにイメージタンパク質間相互作用について説明します。タンパク質相互作用はすべての本質的な細胞プロセスの特徴です。これらの相互作用の多くはそのような共免疫沈降法などの従来の生化学的手法でその識別と分析を防止する、一過性、または精力的に弱いです。この点では、遺伝的にコード化可能蛍光タンパク質(GFP、RFPなど)とそれに関連付けられた重複する蛍光スペクトルは、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)1-3を用いて生体内で弱い相互作用を監視するために我々の能力に革命をもたらしています。受容体相互作用を監視するためのFRETに基づく近接アッセイの使用量を。Protocolプロトコルは、次の3つの主要手順で構成されています。CFP及び/またはYFPの単量体のバージョンへのアミノ末端哺乳類発現ベクターに目的遺伝子の最初の、ステップクローニングにのみ簡単に説明します。2番目と3番目の手順は、FRETを持つEA.hy926内皮細胞へのベクターのDNAのトランスフェクション、および共焦点イメージング、以下でもっと詳しく説明されています。興味の受容体は、CFPとYFPの単量体の強化バージョンにアミノ末端クローニングすることがあります。FRETの決定は経験的であり、蛍光体1の膜貫通領域と開始の間のリンカーの長さに大きく依存です。したがって、リンカのいくつかの異なる長さを調査中のそれぞれの新しい受容体のペアのために検討する必要があります。EcoRI部位に興味のある受容体のクローンを作成する。*注:必要に応じて、NheI部位をSpeIとXbaIでを含む互換性のあるいくつかの他の酵素である。recAのコンピテントセルの行(我々が日常的にMACH1を使用する)にあなたのライゲーション反応を変換する。変異の有無を確認するためにDNA配列決定に続いて、挿入の有無を画面のコロニー。成功した分子クローニングのコンフォメーションを取得後、キアゲン社、または類似の、DNAのキットを使用して滅菌水やTEでトランスフェクショングレードのベクターDNAを準備する。UV分光法を用いて濃縮し、純度を評価する。DNAの典型的な収量は、日常の1μg/μLの作業用ストックに希釈して100から200μgの範囲内でなければなりません。