あなたは控えめに15センチメートルコンフルエント皿から〜15皿(〜90%コンフルエントに翌日)を取得することができます。個々の受容体の発現だけでなく、各受容体のペアのための一皿を評価するための一皿を準備します。2雰囲気下で一晩インキュベートすることができます°Cに翌日、培養物は、〜70〜90%コンフルエントにする必要があります。8μLでキメラ受容体のベクターDNA(2μL)2μgを混合することによりnucleolipid複合体を準備する。受容体のペアの場合は、2μgの(また、以下の説明を参照)の合計については、各受容体の1μgのフェ。静かに転倒混和します。30分間室温でインキュベートし続ける。潜伏期間中に、トランスフェクションのためにセルを準備します。FBS)を添加する前に温かいPBSで穏やかにし、簡単に各プレートを洗浄する。彼らはFugene6による治療中にかなり多くの有毒な細胞になるとして、ペニシリンとストレプトマイシンの存在を避けることが重要です。DMEMから培地を吸引除去する。トランスフェクション後、細胞生存率が比較的高いままにする、無浮遊細胞にはほとんどが観察されるべきである、すなわち。遺伝子発現は、追加の48から60時間後にトランスフェクション後、通常は最大です。画像は24時間可能な限り短く、一般的に実現可能です。最適な遺伝子発現のタイムコース実験を実行する必要があります。AOBS共焦点レーザー走査型顕微鏡で実行されます。2)ステージインキュベーター(PeCon)。実験的なコントロールには、蛍光体の発光チャネルと同様に評価する式の問題や非特異的蛍光体の多量体間のクロストークを除去するために重要です。このように、単一の蛍光体のトランスフェクションは、すべての画像のセッションをセットアップするために利用されています。負の(既知のnoninteracting受容体を使用して)コントロールをFRETは、過剰発現が原因で発生するそのFRETのバックグラウンドを決定するために、実行する必要があります。CFPとYFPの排出チャンネル間のクロストークを排除するために、ステージインキュベーターにCFP発現のコントロールを配置します。-プレートを調整細胞へ。nmのYFPへのCFPの発光検出のためにSPのウィンドウの設定を行います。nmのCFPを励起する。AOTFを使用し、YFPの放出チャネルにCFPの上のかなりの出血を除去するためにレーザパワーを設定します。この設定を保存します。nmで励起パワーを調整することによって、CFPのチャネルでYFPクロストーク(YFPの発現制御を使用して)に対して同じ制御を行います。この設定を保存します。次の場所細胞ステージインキュベーターにCFPとYFPを共発現。ライカ共焦点のソフトウェアのための順序設定を使用して、適切な膜局在化とCFPとYFPの同様なレベルを発現する細胞を見つけます。ライカのソフトウェアのアクセプターフォトブリーチングプログラムを使用して、立派に、保存したCFPとYFPの設定にドナーとアクセプターの設定を設定します。セルにドラッグズーム、YFPの写真破壊が細胞膜で発生し、プログラムを開始することになっているROI(関心領域)を強調表示します。nmで100%にAOTFを調整し、YFPの排出量の70%が枯渇されるまで継続する漂白レーザーを許可する。漂白加速させるために、ROIは通常、レーザーのラスターの軸(X軸)に選ばれている。これらの測定値が偽のFRETの効率を報告できるように光退色時には、細胞の動きを監視し、XY平面でかなりの運動で得られた測定値を拒否する。ポストは前に、それぞれ光退色後のドナーの強度です。JMPソフトウェア(SAS)は、実験的なばらつきの程度を決定するために使用されます。代表的な結果トランスフェクション効率は30〜40%の間、通常です。他のユーザーがこれまでの知見にもかかわらず、我々は一つのベクターのトランスフェクションと発現が、他のことを支持すること見ていない。実際、我々は頻繁にキメラまたはもう一つ蛍光団の排他的な発現を観察。典型的には効率が受容体のシステム間で異なるFRETの。タイ受容体システムの場合、典型的な値は、上皮細胞のための20から28パーセントと内皮細胞の19から23パーセントです。陰性コントロールの場合、典型的な効率は以下の2から3パーセントです。ばらつきの程度は、経験を大幅に減少します。926細胞の代表的な画像。926細胞単層の)DIC画像。B)に表示されているセル()の蛍光画像を。C)オーバーレイ()と(B)〜20-30%のトランスフェクション効率を実証。代表的な受容体は、EA.hy926セルにCFPとYFPの間で発生するFRETの解析を光退色。CFP放出チャネル(上部パネル)とYFP放出チャネル(下の2パネル)には、事前に別々に監視し、後のアクセプターが退色した。退色実験に限定され、緑色のボックス内の領域、から計算された値のFRETていた。1.0)として表示されます。Discussion成功への重要ないくつかのステップがあります。その中で最も顕著には2つのキメラ受容体間の発現の相対的なレベルです。この問題を回避するためには、関心の両方のタンパク質を発現する安定細胞株を作る、または同等の発現を可能にするベクターDNAの最適な比率を識別することができる。同様に、料理全体で不均一なトランスフェクションのために、タンパク質レベルではほとんどの細胞の間で同等できなくなります。そのため、注目は"低"から"ハイ"expressorsを区別するために支払わなければなりません。タンパク質の表示"平均的"レベルは、通常、信頼性と再現性が得られること、それらは効率のFRET。私たちの研究室ではこの問題を緩和するために追求してきた一つの方法は、'even'は遺伝子発現へのアデノとレンティ-ウイルスの使用です。アクセプターフォトブリーチングを決定するための代替方法では効率が感作された排出であるFRETの。されているとはいえ、リアルタイムで単一のセルを監視するために増感発光の可能性にもかかわらず、我々はアクセプターフォトブリーチングより高感度と信頼性が高いことがを発見した。最後に、タンパク質相互作用を監視するためのFRETの使用は困難な場合、および膜結合型受容体のためのリンカーの長さを慎重に選択する必要がありますすることができます。YFPの加算は、しばしば非常に小胞体とゴルジ体に集約におけるタンパク質の発現レベルとの結果に影響を与えます。一時的な、または不安定な相互作用のために、FRETは、利用することが理想的な方法論です。Disclosures利害の衝突は宣言されません。Acknowledgments我々は、共焦点顕微鏡との助けのために博士スコットヘンダーソンの認知を行う予定。DEPTで行われました。NIHNINDSセンターコアグラント5P30NS047463からの資金で、一部では、サポートされている神経生物学と解剖顕微鏡施設、の。gdpr@jove.com.。