配布資料などはSFC-SFSの授業ページで公開します。科目概要DNA解析技術の飛躍的な向上により、微生物程度のゲノム解析はもはや「誰でも」「どこでも」可能なレベルにまで簡単になってきている。携帯型ナノポアシークエンサーの登場は初期投資をほぼ必要とせずに長鎖DNAの解析を安価に可能とした。このような現状を踏まえれば、微生物程度のゲノムであれば遺伝子単位ではなくもはやゲノム単位でDNAを解析することが第一選択肢となる時代が到来していることを意味する。Reportsの形にして国際誌に投稿するまでの全過程を学ぶ。授業シラバス主題と目標/授業の手法などDNA解析技術の飛躍的な向上により、微生物程度のゲノム解析はもはや「誰でも」「どこでも」可能なレベルにまで簡単になってきている。携帯型ナノポアシークエンサーの登場は初期投資をほぼ必要とせずに長鎖DNAの解析を安価に可能とした。このような現状を踏まえれば、微生物程度のゲノムであれば遺伝子単位ではなくもはやゲノム単位でDNAを解析することが第一選択肢となる時代が到来していることを意味する。Reportsの形にして国際誌に投稿するまでの全過程を学ぶ。前半の過程では実際にナノポアシークエンサーに適した長鎖DNAをシーケンスする実験を実習として行い、後半ではシーケンスされたDNAをコンピュータを用いて解析する。イントロダクションナノポアシーケンスと、ゲノム解析の流れについて講義します。1ナノポアシーケンス用長鎖DNAを抽出します。2ナノポアシーケンス用長鎖DNAを抽出します。3ナノポアシーケンス用長鎖DNAを抽出します。4ナノポアシーケンス用長鎖DNAを抽出します。1長鎖DNAの品質をパルスフィールド電気泳動を用いて検証します。2長鎖DNAの品質をパルスフィールド電気泳動を用いて検証します。3長鎖DNAの品質をパルスフィールド電気泳動を用いて検証します。ナノポアライブラリ作製ナノポアシーケンス用ライブラリを作成します。ナノポアシーケンシングライブラリをシーケンスにかけます。得られたゲノムをアセンブルします。エラー補正Nanopolishを用いてエラー補正します。ゲノムアノテーションD-FASTを用いてゲノムをアノテーションします。Reportの形にまとめます。毎回実験ノートをまとめ、次回の準備をするゲノムのアセンブリーファイル冨田研ファイルサーバの/home/gaou/gew/の該当する年度のフォルダの下にそれぞれのバーコードに相当するナノポア配列(fastq)、illuminaフォルダ以下にバーコードに対応するIllumina配列ファイル(fastq)があります。guppyソフトウェアでベースコール後、バーコードのdemultiplexを行なっています。各自自分のホームにファイルをコピーして以降の解析を実施してください。リードのフィルタリングまず、現状ではリードが多すぎるので、だいたいx50~x100になるようにリードを調整します。あとは10000を任意の数字に)すると、任意の長さ以上の配列だけを取得できます。qin=33のようにします。統計値を算出して、カバレッジを合わせます。(https://github.com/marbl/canu)をインストールします。Canuは最新版だと場合によってはまだバイナリが配布されていないので、自分でコンパイルが必要です。その場合、一つ前のバージョンだとLinux版のバイナリが配布されています。指示にしたがってコンパイルするか、バイナリの場合は解凍してください。コンパイルの場合、Javaのバージョンに依存性があるので、あまり古いOSだとコンパイルできない可能性がある点ご注意ください。kingではワーニングたくさんでますが問題なくコンパイルできました。その後canuでアセンブリーを行います。メモリやCPUの関係上kingでやるのが良いかと思いますが、(king利用についてはこちらを参照。maxThreads=8のように打って(BC01.fastqは上でフィルタリングしたfastqのファイル名に、BC01のところは自分のバーコード、あるいは任意の名前に変えてくださいね)アセンブリーを実行してください。-fastオプションは精度を犠牲にして実行速度を上げるオプションで、今回くらいのカバレッジ(x100)があればつけても問題なくアセンブリーできると思いますが、時間がかかっても構わないなら外してください。genomeSizeオプション(頭にハイフンをつけない点に注意)は予想ゲノムサイズより少し大きめを設定してください。バクテリアの場合大抵4mで良いと思います。maxThreadsは、使用するサーバに合わせて設定してください。kingの場合、32に設定してください。大きな問題がなければこれで数時間でアセンブリーが終了します。BC01/BC01.contigs.fastaと打って、ちゃんとアセンブリーが終了したか確認します。末端処理まず環状化ができているかを確認します。BC01.contigs.fastaで各contigのFASTAヘッダを見て、右端のsuggestCircularがyesになっているか確認します。長さが10kbpに満たないsuggestCircularがnoのcontigはゴミの可能性が高いですので、多くの場合破棄して構いません。suggestCircularがyesのものは、染色体かプラスミドの可能性が高いです。BLASTに投げてみましょう。プラスミド配列にヒットするようでしたら高い確率でプラスミドと言えます。ここでsuggestCircularがyesになっていても、環状であることを確認しているだけで環状化されているわけではありません。最初の50文字程度で自身の配列内を検索して、末端部分に該当する場所を見つけてください。基本的に、その後に続く配列が先と部分と末端の該当部分で一致するはずです。一致を確認したら、末端の一致部分を削除します。アセンブリークオリティの検証アセンブリーのクオリティ確認はN50だけではだめで、ちゃんとゲノムとして全遺伝情報がカバーできているか、を確認する必要があります。これらのソフトウェアはインストールが面倒なのですが、理研が開発しているgVolanteというウェブサーバが非常に簡単に使えるようにしてくれています。https://gvolante.riken.jpBUSCOはv.1がバクテリアに対応しています。ナノポアの配列のみでアセンブルした場合、大抵の場合BUSCOスコアが目安となる90%程度を著しく下回ります。これは、多くの場合indel系のエラーが解決されないことに起因します。エラーコレクションエラー補正には、ナノポアリードを使う場合と、Illuminaリードを使う場合の二通りがあります。Illuminaリードがを用いた方が確実に良い結果が得られます。今回この授業ではIlluminaシーケンスを用意しましたので、これを使ってエラーコレクションを行いましょう。新規で読んでいてIlluminaリードがない場合にはnanoporeオンリーのエラーコレクションを行います(非推奨)。Illuminaでの補正Pilonを使います。https://github.com/broadinstitute/pilon/wiki基本的にはBWAでmapping後pilonをかけるだけです。aln.sorted.bam次にpilon。pilon1pilon後に再度gVolanteでBUSCOスコアを算出すると、大幅に向上していることが確認できます。一回では不十分なことが多いので、ここで作成したエラーコレクション後のファイル(pilon1.fasta)に再度Illuminaリードをマッピングし、pilonをかけ直し、BUSCOスコアが向上する限りこれを繰り返します。Nanoporeでの補正nanopolishを使います。indexでfastqとfast5を対応付け、fastqをbwaでリファレンスにマッピングし、実行します。マニュアルだとparallelを用いた方法が書いてありますが、以下のように実行するとシングルで実行できます。8スレッドくらいでやったほうがいいかもしれません。dcm,damオプションをつけることは重要です。これはDNAのメチル化を考慮に入れたベースコールをするオプションで、これが入るとエラーコレクションの精度が大分向上します。(バクテリアゲノムは特にメチレーションが多いため)kingだと例によってwarningは出ますが問題なくコンパイルできます。-fオプションでsequencing_summaryの場所を必ず指定すること(でないと異様に遅い)nanopolishの最適カバレッジはx100~200です。これ以上ある場合にはx200以下までダウンサンプリングしてください。memはいずれもかなり時間がかかるので、同時にかけると良いでしょう。異様に時間かかるので、先にRaconで様子を見てみるのもアリです。DFASTというオンラインツールで全自動でやってくれます。sfc.keio.ac.jp。