軽くボルテックスして。ローラーで培養管を配置し、°Cで一定の回転で30°Cで一晩インキュベートする。午前中は、室温で5分間、800gでローラーや遠心分離機から文化を取り外します。遠心後、上清を完全に取り除く。LiAcのソリューション)とボルテックスで細胞を再懸濁します。変換される各プラスミドおよび追加の制御形質転換のために、マイクロチューブに細胞懸濁液100μlを移す。ngの(コントロールのチューブを除く)の5μlを加える。PEG溶液に追加する)と渦。°Cで30分間ローラー上で30でインキュベートする。70μlを追加し、反転管による混合10から15回(細胞を壊さないようにボルテックスしないでください)​​。15分間42°Cで予め温めておいた水浴とインキュベートにチューブを置きます。水浴からチューブを外し、すぐに2分間氷上に置きます。チューブが冷却した後、室温で5分間、800gで、それらを遠心する。マイクロ遠心機からチューブを取り出し、慎重にピペットを用いて粘性上清を取り除く。滅菌再蒸留水(DDW)150μlの各チューブの細胞ペレットを再懸濁し、そして炭素源として2%グルコースを含む合成完全培地のプレート上となしの細胞懸濁液を広げプラスミドが提供するアミノ酸またはヌクレオチド原栄養。プレートは2分間、オープンのままにし、それらを層流フード内で乾燥させます。二から三日間30°Cインキュベーターでプレートを置きます。mmの直径)がプレート上に出現したら、各形質転換から約10の単一コロニーを選択し、新しいプレートに移す。二日間30°Cインキュベーターで培養する。酵母のパッチが成長しているときは、インキュベータからプレートを取り外し、パラフィルムで、それらを封印。プレートを4°Cで保存することができますすべての10-14日間新鮮なプレートにコロニーを移す。mmの直径)を選ぶ選択肢の原栄養を提供します。遠心機からチューブを外し、上清を捨てる。滅菌DDWとボルテックスの3mlに細胞ペレットを再懸濁します。3mlに上清を、再懸濁します細胞を廃棄、再び遠心する。mlを含む新しい15mlチューブに細胞懸濁液200μlを移し、そしてアミノ酸なしまたはヌクレオチドの選択のプラスミドが原を提供するため。mlを(またはそれ以上の低密度培養のための)転送。gで遠心分離して細胞を収集する。ここからは、β-メルカプトエタノール有毒な蒸気の吸入を避けるために、ドラフト内で動作します。V]β-メルカプトエタノール)で細胞ペレットを再懸濁します。ボルテックスで精力的に混合し、30分間氷上でインキュベートする。ラック内の場所10マイクロチューブを、この目的に、それらの各々に溶解バッファー100μlを移す。N)の様々なボリューム(1〜10μl)を追加します。サンプルを取り、pH指示薬のストリップを使用して溶液のpHを確認してください。インキュベーションの終わりには、ボルテ​​ックスで溶解液と混合する前のステップ(よりよい精度のため、ライセートに先端を挿入せずに、チューブの側面にHCl溶液を置く)で決定した塩酸の体積を加える。vの]ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]とボルテックス(溶液が黄色に変わる場合、それはpHが低すぎることを意味し、溶解液の数マイクロリットルが解決するまで追加する必要があることによりライセートやミックスにブロモフェノールブルーの数粒)青)が点灯します。針とマイクロチューブの蓋に穴を穿刺した後、ヒートブロックで5分間ライセートソリューションを煮る。加熱ブロックからチューブを外し、溶液を室温で2分間冷却することができます。ボルテックス後、ライセート液と10秒のためにそれをスピンダウンする。PAGEゲルに30μlのロード。mlを選ぶ酸またはこれのヌクレオチドは、発現プラスミドは、原栄養を提供します。空のプラスミドを有する制御酵母株に対して同じ手順を繰り返します。ローラーで培養管を配置し、°Cで一定の回転で30°Cで一晩インキュベートする。遠心機からチューブを外し、上清を捨てる。滅菌DDWとボルテックスの3mlに細胞ペレットを再懸濁します。滅菌DDWの3mlの遠心分離工程および再懸細胞を繰り返します。それらの光学密度(OD)を決定するために、900μlのDDWと渦を含むマイクロチューブに各培養液100μlを移す。1mlで満たされたキュベットを使用)波長600nmにおける吸光度を測定する。1.0に細胞懸濁液(1ml)を準備する。選択肢のプラスミドが原を提供するには、2つのアミノ酸なしで合成完全培地を含むプレートまたはヌクレオチドを​​準備する。つのプレートの培地は、2%グルコース、2%ガラクトースと1%のラフィノースと、他の板のようで補足されるべきである。20分間室温で無菌層流フードのプレートを乾燥させるとグリッドの上に置きます。それぞれの文化のため、両方の抑制と誘導するメディア上の行の4つの希釈からスポットを10μl。スポッティング後、数分間フード内でプレートを開いたまま。斑点が乾燥しているときに、プレートをカバーし、2〜3日、30°Cのインキュベーターに置いてください。インキュベーション後、プレートを取り出し、酵母の成長を分析する。最初に、細胞密度が抑制培地を含むプレート上で類似していることを確認してください。その後、誘導培地を含むプレート上で空のベクターを保持する文化に関心のエフェクタータンパク質を発現する培養物の増殖を比較する。注:エフェクターは、標準的な実験の成長条件下での酵母の生育にレート制限されていない細胞プロセスを標的とすることがあります。このようなエフェクターのための成長の阻害の表現型の同定を可能にするために、誘導メディアはエフェクターに対する感受性を増加させるので、酵母の細胞機能を変化させる化合物を補給することができます。この手順に統合することができます化学物質のリストについては、パーソンズらを参照してください。