FavoritesSummaryこのビデオでは、我々は酵母における細菌のタイプIIIエフェクターの発現とエフェクター誘導性成長抑制の表現型を同定するための手順を説明します。そのような表現型は、その後、エフェクター機能と目標を明らかにするために悪用される可能性があります。here.Abstract多くのグラム陰性病原性細菌は、宿主細胞のサイトゾルへエフェクタータンパク質のスイートを転位するタイプIII分泌系を使用してください。セル内で、タイプIIIエフェクターの免疫応答を抑制し、病原体の成長を促進するため、ホスト細胞プロセスを破壊する。植物と動物の細菌性病原体の多数のタイプIIIエフェクターは、これまでに同定されており、まだそのうちのほんの数は十分に特徴付けされています。これらのエフェクターの機能を理解するために、彼らは病原性、特定の感染症の段階におそらく固有の役割、および遺伝的に困難を増加させる及ぼす可能性があることを微妙な効果は、特定の細菌株のエフェクターレパートリーの中で機能的な冗長性の組み合わせによって損なわれている特定の病原体を操作する。出芽酵母におけるタイプIIIエフェクターの発現ProtocolI.は、タイプIIIエフェクターのために酵母発現系を設計する興味のエフェクタータイプIII(S)の発現に適した酵母のシステムのキャリブレーションは重要な課題であり、いくつかの試行錯誤が必要になる場合があります。このようなシステムを設計する際に考慮し、最適化すべき主要な関連性の要因である:1)プロモーターは、2エフェクターの発現(s)を駆動)エフェクター遺伝子のコピー数は、3)エピトープタグタンパク質の発現を検証するために使用する、および4)酵母株。細菌のタイプIIIエフェクターの酵母細胞への毒性がある可能性があるため、誘導性プロモーターは、それらの発現を制御するために使用する必要があります。GAL1プロモーターは、一般的にこの目的のために使用され、その活性は増殖培地中に存在する炭素源によって規制されています:それは、グルコースによって抑制とガラクトースによって誘導される。このプロモーターは望ましくない毒性をもたらす抑制条件下でわずかに漏れやすいと報告された。同様の問題が発生した場合、それは以下のようにエフェクター遺伝子のコピー数を最小限に抑えるために、またはそのようなMET3またはCUP1プロモーター1などの代替誘導性プロモーターを、使用することをお勧めします。ここでは、ガラクトース誘導性プロモーターからのエフェクタータンパク質を発現させるための手順について説明します。2)遺伝子のコピー数タンパク質の発現レベルに影響を及ぼす追加のパラメータは、セル内に存在するエフェクター遺伝子のコピー数です。高い発現レベルは、エフェクター遺伝子(セル当たり40〜60枚)2ミクロンプラスミドによって運ばれるときに達成されています。中間式は、エフェクター遺伝子が相同組換えによって、酵母ゲノムに統合されている場合、低発現が達成されるのに対し、動原体を含むプラスミド(細胞あたり1から3のコピー)を使用して取得されます。セントロメアを含むベクターおよびGAL1プロモーターを組み合わせることで我々は成功し、植物病原体グラム陰性細菌のPV。PVの約50エフェクターを表明している。3)エピトープタグ興味のエフェクターに対する抗体が使用できない場合は、エピトープタグは、免疫ブロットによってその発現をモニターするためのエフェクタータンパク質に融合している。一般的に使用されるタグは、Mycの、ヘマグルチニン(HA)またはフラグです信頼性の高い商業抗体が用意されていますになる。我々はエフェクタータンパク質の構造と活性に不要な有害な影響を最小限にするためにタグのコピーを1つだけ使用することをお勧めします。発現に使用する酵母菌株の基本要件は、発現ベクターの選択マーカーの栄養要求性である。異なる酵母株は、特定のエフェクターの発現に異なる感度を表示するかもしれないことに注意することが重要です。我々はBY4741とW303株はいくつかのグラム陰性細菌のPV。vesicatoriaエフェクター(サロモンとSessa、未発表)に異なる感度を持っていることを観察した。したがって、異なる酵母株への関心の(の)エフェクターをテストするのが好ましい。V]グルコース)を使用します。私たちは、最終容量の90%で、グルコースを含まない培地を調製し、これをオートクレーブをお勧めします。Cの汚染を防止するため、4で20%グルコース溶液を保つ)で100%にボリュームを埋める。vの]ラフィノースを含む。V]寒天液に2%を追加。私たちは、最終容量の90%で培地を調製し、これをオートクレーブをお勧めします。4で10%ラフィノースソリューション°Cの汚染を防ぐため)。g/100ミリリットルトリプトファンの株式からL)。ロイシンとウラシル株を調製する際に、オートクレーブでそれらを滅菌し、室温でおいてください。フィルタリングすることにより、それらを殺菌、ヒスチジンおよびトリプトファン株を調製する際に、光から保護するためにアルミホイルで瓶をラップし、4°Cで保管°C、手順では、以下のロイシンを添加した合成ドロップアウト培地を説明し、ウラシル、ヒスチジンおよびトリプトファンを合成完全培地として指定されています。ソリッドメディアプレートを4°Cで2ヶ月間まで保存することができます使用前に、室温で無菌層流フードで20分間プレートを乾燥させる。