変動は完全に未知であったが、我々はこれまでに高性能な蛍光性温度センサーと高感度かつ高い定量性を備えた蛍光イメージング技術を用いて、単一細胞内の温度測定法や生細胞内における温度分布のイメージング法を開発した。これにより、単一生細胞内には細胞機能に関連した有意な温度変化や、空間的に不均一な温度分布が存在することを発見した。このような細胞内温度の不均一性を保つメカニズムやその生理的意義は一切不明である。着目して、外部要因による変動の感知あるいは自発的な誘起と維持を担うメカニズムを解明するとともに、方法の性能と応用性を改良して、リズムや体温調節といった高次生命現象に対して実践することで生理的意義を解明することを目的としている。これを達成するために、神経細胞を含む多数の培養細胞における温度分布を定量的に観察するシステムの開発と応用を行なった。細胞内局所を人工的に加熱する方法を神経細胞の分化や培養細胞内ストレス顆粒(SG)形成といった現象に応用することで、細胞内温度シグナリングの分子機構の解明に応用した。ストレス顆粒形成における分子機構の解明を達成した。共同研究を進めるため、種々細胞内における温度イメージング法の開発や細胞内分子と温度の同時イメージングを行った。ポリマー温度センサー(FPT)を用いることにより、多数の細胞内における温度可視化法を開発した。これを用いて、発熱化合物のスクリーニング系を確立した。ライブラリーを用いて、一次スクリーニングとしてプレートリーダーによる蛍光検出を、次に蛍光寿命イメージングによる二次スクリーニングを行なった。次に、細胞内温度シグナリングの検討を行なった。分化誘導した神経様細胞PC12や分散培養神経細胞(ニューロン)に対し、FPTと蛍光寿命イメージング顕微鏡法(FLIM)を用いて、温度イメージングを行なった。この結果、他の培養細胞と共通した温度分布の特徴に加えて、神経細胞特異的な温度変動を発見した。これの細胞機能への貢献を解明するため、細胞内局所加熱を行なった。この結果、人工的加熱により神経機能に重要な突起伸長が亢進した。細胞内温度変動を阻害したところ、伸長が阻害されたことから、神経細胞分化における温度シグナリングの存在を解明した。次に、これまでに解明した細胞内温度シグナリングであるストレス顆粒(SG)形成について、その分子機構を検討した。SG構成分子であるmRNAの一分子直接観察により、SG形成時のmRNAの動態の変化およびSG形成時の細胞内局所的な発熱の動態を詳細に解析した。より翻訳中mRNAの複合体が不安定化し解離することがSG形成開始のスイッチとなることを明らかにした。共同により線虫個体、ニワトリ脊髄後根神経節、マウス脳スライスにおける細胞内温度イメージングを行なった。チャネルの活性化のための実験系構築や、ショウジョウバエ細胞内における温度イメージング法の開発と応用を行なった。今年度は最近開発された超高感度蛍光寿命イメージングシステムを導入することで、細胞内の温度イメージングの実時間観察を行う。これまでは定量的な温度計測を行うには蛍光寿命計測に多数の光子が必要であり、蛍光寿命イメージングはスナップショットに限定されてきた。より蛍光寿命イメージングのタイムラプス観察を行う。これにより細胞自発的ないし人工的加熱時の温度変化をリアルタイムイメージングする。細胞内温度変化に対する細胞応答(温度シグナリング)を検討するために、温度イメージングに加えて、これまでに開発した赤外レーザー照射や金ナノ粒子への可視光レーザー照射による細胞の任意の場所を定量的に加熱する方法を種々の細胞へ応用し温度シグナリングの分子機構を検討する。これまでに発見した神経機能やストレス顆粒形成時における温度シグナリングの特徴を詳細に検討するとともに、種々の化学刺激や阻害剤、動作分子の直接観察により温度シグナリングのメカニズムを調べる。細胞内温度の時空間的不均一性の原理を探るため、細胞内熱動態に与える影響を細胞骨格や細胞内高分子の視点から詳細に解明する。これにより、細胞内における熱と分子の相互作用様式を解明する。