2013)を細胞にトランスフェクションした後、48時間培養を行った。reagentを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後、培地を無血清培地に換えて48時間培養した。reagent(lnvitrogen)を用いて1回目のトランスフェクションを行った。48時間培養したのち、1回目と同様に2回目のトランスフェクションを行った。2回目のトランスフェクション時に、培地を無血清培地に換えて48時間培養した。Healthcare)を用いてRNA抽出およびDNaseI処理を行った。Kit(TOYOBO)を使用し、cDNAを合成した。Kit(TOYOBO)を用いてcDNAを合成した。mlの培地を回収した。この時、細胞は、10-cmディッシュでコンフルエントの状態であった。mlの培養上清から抽出した。Scientifics)を用いて抽出した。Scientifics)用いて抽出した。Kitを用いて精製した。Kitを用いて逆転写を行った。Scientifics)をトランスフェクションし、同じ処理を行ったSH-SY5Y細胞の培養上清を使用した。2012に記載されたPCR条件に従って行った。RNA編集部位のPCR増幅およびその解析PCRは、表1に示すプライマーペアを用いて、表2に示す条件で行った。Kit(QIAGEN)を用いて精製した。Technology)を用いた定量解析で算出した。Biolabs)で切断した。編集率は、編集されたRNA(編集RNA)と編集されていないRNA(未編集RNA)に由来するバンドの和に対する、編集RNAのバンドのモル比で示した(表5)。Scientifics)を使用して算出した。softwareを用いて行った。2群の統計的比較には、マン・ホイットニーのU検定を用いた。P<0.05の時に有意差有りとした。RNA編集部位を同定した。RNA編集部位の検出可能であることが示唆された。RNA編集部位のうち、102部位おいて、AR2マウスにおける編集効率が野生型マウスにおける編集効率よりも2%低かった。RNA編集部位と相同部位を検索したところ、ヒトRNAとマウスRNA間で28カ所の相同部位を同定した。RNA編集部位(表6)が、ADAR2活性依存的に編集率が変化する編集部位なのかどうかを、ヒト由来の培養細胞を用いて検討した。培養細胞中でADAR2を過剰発現させ、上記28の部位における編集率の変化を調べた。mRNAのQ/R部位)において、編集率が有意に増加した(図2Bおよび図3B)。次に、SH-SY5Y細胞のADAR2をsiRNAでノックダウンした後、これら10の部位における編集率の変化を調べた。mRNAの発現量は、有意に減少していた(図3C)。mRNAのR/G部位であった(図3D)。他の6カ所については、ADAR2をノックダウンしない状態の元々の編集率が低いため、ノックダウンによる編集率の変化を検出できなかった可能性が考えられる。RNA編集部位でADAR2がA-I変換を行っていることが示唆された。RNA編集部位であるとの報告はない。RNA編集部位を持つmRNA(ADAR2、CYFIP2、GluA2、SONおよびTMEM63BのmRNA)が細胞から分泌されるかどうかを調べたところ、SH-SY5Y細胞の培養上清中にこれら5種類全てのmRNAの存在が確認された。RNA編集部位の編集率を調べた。RNA編集部位の編集率は、細胞内RNAの編集率と同じ様に変動する傾向にあった。mRNAのQ/R部位においては、その編集率が有意に増加した(図4A)。mRNAのQ/R部位における編集率が有意に減少していた(図4B)。GRIA2(hsa_circ_0125620、hsa_circ_0125618およびhsa_circ_0125619)を見出した。2013)と一致していた。primerを用いてPCRを行ったところ、SH-SY5Y細胞中において、hsa_circ_0125620は再現性をもって検出できたが(図5A)、hsa_circ_0125618とhsa_circ_0125619は検出できなかった。HpyCH4V認識部位が存在しているのに対し、Q/R部位が未編集型のhsa_circ_0125620に由来するPCR産物には、さらに1カ所(合計3カ所)の認識部位が存在している(図5B)。mRNA(直鎖状mRNA)の編集率(平均で87%)よりも高く、ADAR2ノックダウンにより有意に減少した(図5C)[0041]次に、SH-SY5Y細胞の培養上清中におけるhsa_circ_0125620について検討を行った。ml以上の培養上清が必要であった。SH-SY5Y細胞の培養上清中のhsa_circ_012562のQ/R部位は、ADAR2のノックダウン後であっても、ほとんどが編集された状態であった。クロマトグラフィーをよく見てみると(図6の挿入図)、ノックダウンの方には、僅かではあるが172bpのフラグメントが確認できた。GRIA2が分泌されていることが示唆される。GRIA2のほとんどがQ/R部位編集型である可能性が考えられる。2015)を考慮するとこのような可能性も十分あり得る。GRIA2のQ/R部位の編集率が低下している可能性が高い。RNA編集部位のヌクレオチドを同定する工程を含む、前記方法。[請求項2]ALSの病態を診断する方法であって、以下の(a)~(d)の工程を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。GRIA2(has_circ_0125620)の核酸配列中第409番目であることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。[請求項4]前記診断サンプルが体液由来であることを特徴とする請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。[請求項5]前記体液が、髄液または血液のいずれかであることを特徴とする請求項4に記載の方法。RNA編集部位を有する1または複数のRNA分子からなるバイオマーカー。GRIA2(has_circ_0125620)の核酸配列中第409番目であることを特徴とする請求項6に記載のバイオマーカー。RNA編集部位を有する1または複数のRNA分子のALSバイオマーカーとしての使用。GRIA2(has_circ_0125620)の核酸配列中第409番目であることを特徴とする請求項8に記載の使用。RNA編集部位のヌクレオチドを同定するための要素を含むキット。