こんにちは、生物系の研究室の学生です。現在JavaScriptが無効になっています。Yahoo!知恵袋のすべての機能を利用するためには、javaScriptの設定を有効にしてください。JavaScriptの設定を変更するには「JavaScriptの設定方法」をご覧ください。こんにちは、生物系の研究室の学生です。組み換えDNA作成の実験で問題が発生したた...シェアツイートはてブ知恵コレphi********さん2017/8/1700:20:41こんにちは、生物系の研究室の学生です。組み換えDNA作成の実験で問題が発生したため、ご助言いただければと思い質問させていただきました。現在、遺伝子組み換え大腸菌作成のため、タンパク質発現用のプラスミドにORFを組み込む実験を行っています。目的のプラスミドが作成できたかどうかを確認するためにPCRと制限酵素処理を行っています。ここからが問題で、PCRで確認した時は目的のバンドが出てくれるのですが、制限酵素処理を行った時、ベクターのバンドのみが現れ、ORFのバンドが出ないという予期せぬパターンで観測されるのです。この場合どのような原因が考えられるでしょうか、ご助言いただければ幸いです。補足本日研究室のボスと議論をしてみて、コロニーPCRでバンドが増えたのは大腸菌をまいた際に駅中に残っていたORFを拾ってPCRをしており、大腸菌に組み込まれたのは2量体化したベクターだったためORFのバンドが見えなかったのだという結論に至りました。明日検証実験を行う予定なのですが、ベクターのみがつながれたものが導入されるといったことは本当に起こりうるのでしょうか。起こるとすればどういった条件の時でしょうか。0閲覧数:114回答数:4違反報告ベストアンサーに選ばれた回答https://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question_detail/q12178124832pla********さん2017/8/1708:10:03通常、コロニー選抜はPCRでの確認だけで十分だと思います。後はシークエンス解析を行って配列を確認したほうが良いでしょう。予期せぬパターンになるのかについては細かい条件がわからないので何とも言えません。PCRの条件は?どの位置にプライマーを設計してバンドが確認できているのか。制限酵素処理が問題なく行われているのでしょうか?切れることのわかっているベクターに対して処理してみる。制限酵素の位置は?その制限酵素処理というのは元のベクター上にある配列、それともORFとして導入した配列なのか。0違反報告この返信は取り消されました。00:33:47みなさん多数のご回答ありがとうございました生成したプラスミドをPCRにかけてみたところバンドが一切出ませんでしたまた、制限酵素処理で2つの制限酵素を用いていたのですが、それを1つにした場合ベクター×2の大きさの箇所にバンドが出ていたため、ボスの言う通りになっていたのかなと考えました。PCRのプライマーは、ベクター配列を認識するものですか?もしそうであれば、ORFが入った場合はORFのバンドが確認され、入って無い場合は、短いバンドが確認されるはずです。そのような設計であれば、残ってたORFには反応しません。制限酵素処理してないプラスミドを流せば、2倍なのかは確認できると思います。両はしを切断するために2種類の制限酵素を使っていると思います。一つずつ切ったものを電気泳動で切断されているか確認したほうが良さそうですね。ライゲーションはできていで、制限酵素処理でどちらか一方しか切断されてない。両方切断されてないのかな。コントロールを置いて、きちんと確認したほうが良さそうですね。0違反報告https://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question_detail/q12178124832カテゴリマスターmad********さん2017/8/1709:14:27PCRは、ベクターに組み込まれたORFだけが増えるように設計していますか?それとも、ORFだけでも増えるような設計ですか?後者なら、コロニーPCRでプレート上のORFフラグメントをそのまま増やしたか、試薬等を貴方が汚染させてそれが増えているのでは。何をネガコンとしていて、ネガコンの結果がどうなっているのかを確認しましょう。一覧を見るプラスミドのシーケンス確認の仕方についてです。ライゲーションにて新しいプラス...昨日プラスミドをライゲーション処理し、それを使って今日大腸菌を形質転換させた...ライゲーションとトランスフォーメーションについて質問です。PCRによって増やし...ライゲーションが上手くいかずに困っており助言をお願いします。5kbのベクターに2...ライゲーションについて現在、酵母のある遺伝子をPCRによりランダムに変異を入れN...「ライゲーション、プラスミド」に関する質問プラスミド、及びPCR産物の制限酵素処理後の電気泳動において、目的のバンドよ...プラスミドDNAの制限酵素処理の実験です。使った酵素は1Hind32BamH13EcoR1です。本庶さんとアリソンが共同で受賞しました。私は個人的に病的なほど衛...排水処理(活性汚泥)についての質問です。一覧を見る唐揚げや一夜干しなど作る時に、醤油だれに漬け込んだりしますよね。ウイルスの電子顕微鏡写真はどういう...涙と房水は同じですか?区別がはっきりしません。...3唐揚げや一夜干しなど作る時に...4シーケンスをかけた際にポジテ...5子どもが二重で生まれました。回答数1最近、旦那とイオンモールで食べて...2嫁の言葉に混乱中です。一緒に住...3辛いです。誰にも話せないのでここ...4今日の飲み会で新入社員を誘いまし...5息子が昨年、5年付き合っていた彼...6嫁の両親との外食で食べ放題に行き...7ケチと言われました。皆さまの一...8シングルマザーの彼女と付き合って...917の男です最近曾祖母が頻繁にお小...10家計が毎月赤字にも関わらず妻が働...ランキングをもっと見る1貧乏は不幸ですか?お金持ちは幸せ...2自分さえよければ他人なんてどうで...2「海鮮丼」と「カツ丼」どちらの方...2タイトルに「long・ロング・長」を...5家にマスク、何枚ありますか?5タイトルに「est」を含む素敵な曲...5春を感じさせる一曲を教えて下さい...8男の人に質問ね。女に何を期待...8ブレーキ液って。JAPANは、回答に記載された内容の信ぴょう性、正確性を保証しておりません。お客様自身の責任と判断で、ご利用ください。研究機関に提供します。投稿者が誰であるかを知ることはありません。Reserved.「追加する」ボタンを押してください。閉じる※知恵コレクションに追加された質問は選択されたID/ニックネームのMy知恵袋で確認できます。追加する不適切な投稿でないことを報告しました。