臨床検査において蛍光染色は、顕微鏡検査や電気泳動ゲル染色およびフローサイトメトリー法などに頻用されている分析技術の一つである。抗原・抗体もしくは糖鎖・レクチンなどの生体親和性物質に標識し、その応用域も広く多岐の分野に渡る。近年、蛍光分析は、生細胞の代謝動態マーカーとして、各種プローブや蛍光標識物および蛍光タンパク質などを使用した分子生物学分野では不可欠な技法として高く認識されている。ついて、その方法論と留意点および幾つかの応用技法とを合わせて紹介する。詳細な染色操作等は参考文献を参照頂き、操作説明の記載を簡素化した。アクリジンオレンジの特性アクリジンオレンジは単染料で試料成分に応じて、異なる蛍光色を発する。髄膜炎患者の脳脊髄液試料を染色すると細菌は赤色に、背景細胞は対照的な緑色や黄色に染まる。原虫の場合、細胞質は赤に、核は緑色に染まる。No.:65-61-2の染料物質である。アクリジンオレンジは細胞周期の決定に有用な核酸の選択的蛍光カチオン性染料で、細胞透過性であり、インターカレーションや静電気力によりDNA、RNAと相互作用する。DNAに結合した場合は、励起極大502nm、発光極大525nm(緑色)と蛍光スペクトル的に非常に類似している。RNAや一本鎖DNAと会合すると、励起極大460nm(青色)、発光極大650nm(赤色)にシフトする。アクリジンオレンジはリソソームの酸性コンパートメントに入り、プロトン化されて蓄積する。青色光によって励起されたとき、低pH条件において、色素はオレンジ色の光を放出する。よって、アクリジンオレンジは貪食時に蛍光を発するので、貪食したアポトーシス細胞の同定に使用できる。原生動物を含む核酸含有細胞の蛍光染色に使用することが多い。non-culturable等への手軽で迅速な対応染色法としてもっと多用されるべき方法である。アクリジンオレンジ染色には多くの改変法と応用がアクリジンオレンジ染色は染料濃度や溶媒の種類およびpHもしくは他染料との組合せ等により多くの改良と応用が報告されている。アクリジンオレンジによる蛍光顕微鏡検査は簡易かつ迅速であり、ヒト由来細胞の核は黄緑色、細菌はオレンジ色と鑑別し易い蛍光を発するため低倍率での検出が容易で、感度も高い。0.15M酢酸緩衝液(pH3.5))で2~5分間染色)以外は通常操作と同様に染色できる。新生児菌血症の迅速診断ではバフィーコート(血液を遠心分離して生じる白血球の層)染色にも応用されている。ヘマトクリット管を遠心後、バフィーコートと赤血球の境界面で毛細管を折り、スライドガラス上にバフィーコート標本を作成し、以降は通常の操作で固定染色する。vaginalis感染症のための簡易で感度の高いスクリーニングテストなどもある。以下に具体的な応用例を示した1)2)3)4)。4.0)5.0mLに加える。細菌はオレンジ色に、ヒト細胞は黄緑色に染まる5)。弱酸性アクリジンオレンジ染色液を感染が疑われる脳脊髄液や体腔液などヒト由来細胞が混在する細菌数の少ない標本に応用する。染色標本を落射蛍光顕微鏡(FITCフィルター)弱拡大X100~X400倍で観察する。確認は強拡大X500~X800倍の油浸対物レンズで行う。同標本によるグラム染色重染色も可。細菌は、黒、黄緑または黄色の背景に、鮮やかなオレンジ色に染色される3)6)。尿中細菌数および液性試料の総菌数計測アクリジンオレンジのアルカリ性染色液によりウェットマウント法での迅速な細菌尿の診断および液性試料中の細菌数計測への応用。本法は比較的菌量の多い試料に適した方法である。小試験管にi液0.8mLを入れる。ii液25μLを加える。試験管から一定分量を取り出し、トーマ細菌計数盤に入れる。細菌は明るい蛍光の赤い点として観察される7)。アクリジンオレンジ染色による血液塗抹標本からのマラリア診断アクリジンオレンジによる蛍光染色は簡易かつ迅速なためマラリア原虫の感染の有無の判定には有益であるが、熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、卵形マラリアおよび四日熱マラリアの4種の虫種鑑別にはギムザ染色標本による形態鑑別が必要である。カバーグラスを濾紙などの上に置き、少量のアクリジンオレンジ液を1滴たらす。アクリジンオレンジ溶液を載せたカバーグラスを、固定標本に軽く押し付ける。以下カット)の組み合わせで観察を行う。核:緑~黄色、細胞質:鮮やかな橙色の蛍光を発する。アクリジンオレンジ染色のマラリア診断はギムザ染色より感度が高い。マラリアの虫種鑑別法や他の検査法に関しては以下の資料を参照。よる結核症は世界全体で22億人が感染し、年間170万人が死亡している。日本でも年間約25,000人が発病し、約2,100人が死亡している重大な感染症である。(WHO:2007)結核菌は抗酸菌として位置づけられている。結核症におけるヒトの体内で休眠状態から活動性疾患へと浮上する結核菌の潜伏機構についてはCD271+間葉系幹細胞に隠れることまでは示されていたが、部位は不明であった。Dasらにより、治療後の骨髄間葉系幹細胞CD271+BM-MSCsの低酸素ニッチに潜んで免疫系から逃れる結核菌の持続的存在の臨床的証拠が報告され、治療への貢献が期待される10)。cayetanensis)などが挙げられる。これらの抗酸微生物染色では、Ziehl-Neelsen(Z-N)改良法やKinyoun法を用い脱色液を改良することにより染色の改善が得られている。蛍光抗酸染色でも同様に条件設定が必要かも知れない。本稿では結核菌を主体としたMycobacteriumの抗酸染色を記述する。蛍光抗酸染色は抗酸菌特にM.tuberuculosisを高感度に検出する目的で開発された。従って同じ抗酸菌群でもミコール酸構成が異なるMycobacteria属菌種では、染色法により染色時に加温した方が染色性の向上がみられる菌種や菌株がある。ローダミンB染色、がある。これらは、染料濃度や試薬組成および対比染色剤等の組合せにより幾つかの変法に分かれる。近年ではオーラミンO染色を改良した迅速染色法やSYBR®-Goldを用いた蛍光抗酸染色法も報告されている。最近は、蛍光抗酸染色液を自家調製する施設は少なく、多くの施設が市販キットを採用しており染色試薬管理の問題は低減している。染色液の使用頻度や保管温度、四季の染色室内温度などの施設間差は大きく、抗酸染色の管理は重要である。抗酸菌の染色検査では、標本作製から染色操作全般において感染の危険性が高いM.tuberuculosisの存在を強く認識したバイオハザード対策を怠ってはならない。acids)は、炭素数60~90個程度の大きな超高級脂肪酸の総称で、ロウ様物質、ワックス成分などと呼ばれる疎水性成分である。ミコール酸は純物質ではない。結核菌では細胞壁(ペプチドグリカン)の外側にあるアラビノガラクタンの外側すなわち最外周部で自身を保護している。ミコール酸層は内側のアラビノガラクタンと結合し、ミコール酸同士はトレハロースと結合している。この構造が抗酸染色の独自機構を生んでいる(図1)。結核菌は増殖するときにこのミコール酸を合成している。本剤は潜伏感染結核菌にも有効であることから結核菌特有のニトロ還元酵素の代謝を受けて産生した一酸化窒素による細胞障害活性をも併せ持つことが示唆される。抗酸微生物のミコール酸構造と特性を知ることは抗酸染色可否の重要な知識源となり得る。Hらの詳細なレビューを参照頂きたい11)。試薬組成と添加量を表1に一覧化した。本稿では前述のように試料の前処理法など蛍光抗酸染色以外の操作は成書および参考文献を参照頂き、染色液を被覆する操作から記述し簡素化した。空気乾燥、濾紙などで吸い取ってはいけない。抗酸菌は暗い背景に明るいオレンジ色の桿状に見える。標本の染色には熱を加えない。染色にフィルターストリップを使用しない。過マンガン酸カリウム染色では時間は重要であり、長い対比染色は抗酸菌の蛍光を減衰する。※アクリジンオレンジは、対比染色剤として過マンガン酸カリウムの代わりに使用することができる。laboratory社から市販されている14)。