抗酸菌は明るい黄緑の蛍光、一部赤色のバックグランドの領域がある検体がある。抗酸微生物は、オーラミンOで染色されるが、M.chelonaeとM.scrofulaceumの2菌種の標準オーラミンO法との一致率は80%と報告されている。スライド標本にi液を被覆し15分間染色*1。フィルターストリップは使用しない。スライド標本にiii液を満載し、2分間対比染色iii液による対比染色時間は重要で、長過ぎると抗酸菌の蛍光が減光する。ローダミンBで染色した抗酸菌とバックグランドとのコントラストを落すため本法の対比染色には不向きである。間と記載されたものや、60°C・1時間と指定したものなど多様である。不足では染色性が低下するが、染色時間の延長は好結果が得られる。染色液温度の低下は急激に染色性が損なわれる。Slide(Cat.No.231391)など各社より市販されているもの、または、既知の抗酸性と非抗酸性菌とを使用して、染色毎に実行することを勧める18)。蛍光染色標本は染色後褪色が見られる。一時的な褪色防止策としては、冷暗所に保管する方法がある。褪色防止を講じる方法としては、各社から染料に対応した褪色防止用封入剤が市販されている。これらの製品は蛍光免疫染色を目的とするためDAPI添加製品もあるので留意すべきである。Mediumなどがある。主要な3種の染料系と各々の変法が存在するが、以下の染色操作上の留意点はいずれの染色法にも共通である。70%アルコール)時間は1~3分間との記載が多いが、充分な脱色には2~3分間が必要である。グラム染色などでは過脱色は禁物であるが、蛍光抗酸染色では逆に脱色不足は禁物である。脱色操作中の脱色液の追加もしくは交換はより効果的である。95%エタノールや25%硫酸)と比較しても極めて穏やかである(図2)。対比染色の時間厳守:脱色時間とは逆に対比染色時間は厳守すべきである。対比染色液としては、主にメチレンブルー、過マンガン酸カリウム、アクリジンオレンジ、エリオクロムブラックTなどが用いられる。対比染色は非特異的な蛍光を抑制する反面規定時間より長くなると本来の蛍光を抑えるため時間を厳守すべきである。抗酸染色は長めが良い:蛍光抗酸染色の本染色は通常、室温15分間と指定されたものが多いが染色時間は20、30分間以上と長めの方が良く染色されることが多い。長時間染色する場合は、高温で加温しないことと染色液が乾燥しないように留意すべきである。塗抹標本は厚くしない:塗抹標本が厚いと脱色が適切に行われない、存在する抗酸菌を覆い隠す、材料がひび割れし易く操作中に剥がれることがある、陽性標本の剥離片が他の標本に付着する可能性も否定できないなどの弊害を生む。蛍光抗酸染色の確認染色:蛍光抗酸染色によって陽性と判定された塗抹標本は、結果確認のために同標本を使ってZ-N染色やKinyoun染色で重染色することができる。この場合、そのままでは重染色でき難い標本が有るが、染色標本を5%シュウ酸液で2分間処理後水洗し、そのまま重染色するとよい。シュウ酸処理後に同じ蛍光抗酸染色で染色し直すことも可能である(染色後すぐに観察できなかったときや、再確認時に蛍光褪色の可能性が疑われる場合、または教育機関での染色実習の反復使用にも有効である)。逆に、Z-N染色した標本は蛍光抗酸染色できない。蛍光染色標本の褪色防止:蛍光抗酸染色標本は褪色し易いので光を避け、染色後できるだけ早く観察する。染色標本を保存する場合、遮光は原則であり、アルミホイルもしくは黒色の紙に包んで冷蔵庫に保管する。各社より褪色防止封入剤も市販されているので、最適な封入剤の購入も一策である。寒冷期、寒冷地の染色液温染色時間には要注意:抗酸染色ではミコール酸構造が関与するため染色室の室温が下がる寒冷期や寒冷地での染色性は極度に落ちる。15°C以下では要注意である。加温器の準備がない施設での応急処置としては、使用済み角形細胞ボトル(スライド密着性が高い)に水とお湯を足して適温(35~60°C位:染色法により最適温度が異なるため事前に検証する)に調整したお湯を満杯にして発砲スチロールの上に寝かせ、その上に角を立てた家庭用アルミホイル(熱伝導が高く、染色液の保持ができる)を引くと標本と密着性の高い保温器具の代用が簡易にできる(図3)。寒冷な染色室では管理用標本の併用は不可欠である。抗酸染色試薬は標本全体を被覆:スライド標本には試料塗布部位だけでなく標本全体に試料中の微生物が飛散している可能性が高い。従って、染色液は標本全体をフェノール殺菌する意味で全体を被覆するように満載する。重要な固定操作の過剰な過熱(燃焼)は過脱色を招く:固定法としては、65°C~75°Cで2時間もしくは80°Cで15分間の熱固定法やバーナー上を3回ほど横切らせる火炎固定法があるが、過剰な加熱は過脱色を招く。この他、メタノールで2分間固定する方法もある。しただけの塗抹標本を染色するとスライドから試料が剥離・離脱することがある。この他の留意点としては、蛍光染色では水洗が不充分だと染料の結晶片が残り、判定し辛いことがある。洗浄水として、水道水は季節や地域により塩素濃度および微量イオン含量が染色性に干渉する可能性があるため、高純度精製水の使用が望ましいが、通常の染色では簡易精製水で充分である。抗酸染色の観察では、試料の陰性を決定するのに最も労力を要するが、決定には×200~×400の倍率で少なくとも30の個別フィールドを調べる(図4)。Goldを用いた染色法が報告された。DNA/RNAへ結合すると>1000倍増強蛍光を呈するためバックグラウンド蛍光が低い。褪色に強く、オーラミンOよりも強い蛍光を発するという特徴を持つ。臨床材料への応用データは無いが、好気的条件下で活発に増殖もしくは低酸素条件下培養の非増殖M.tuberclosis両方の99%を検出した。ローダミンBによる蛍光顕微鏡検査では、M.tuberclosisの検出率は54~86%であったと報告されている19)。Goldを1:1000の比率に染色希釈液で希釈し染色使用液とする。菌体は黄緑色に見える。抗酸染色は当初加熱染色から非加熱染色へと変遷し、蛍光抗酸染色では加温を禁じた染色法もある。ミコール酸が重要なポイントとなる抗酸染色では、寒冷地や寒冷期の染色性が落ちるのは周知の現象である。いかなる地域や季節においても良好な染色性の保持、迅速な染色時間、明瞭な染色を達成する技法としてmicrowave法が用いられる。Microwaveは電磁波により迅速に水分を含む食品などを発熱させる加熱調理器具として重宝され、一般家庭では電子レンジとして普及している。電磁波の周波数は2.45GHzである。今日では、家庭用(500~1000W程度)として安価な製品も市販されていて、充分な予備実験を重ねれば使用に耐え得る。染色液組成などには充分な配慮が必要である。microwave照射による染色液での染色は同温度に加熱した染色液より鮮明に染まる傾向が見られる。-極およびS,N極の相互変換を反復する物理科学現象に起因するものかは明確でない。)らのグループは、染色液が照射により飛散しないように試薬組成を工夫し小型タッパー内にスライド標本を入れ、殺菌処理した標本に染色液を被覆後、直接500W・10数秒間の照射により、迅速かつ高い染色性を得ている。Microwaveで加熱するのは、抗酸染色の本染色液工程のみで以降の操作は従来法通りである。ローダミンB法とZ-N法である。オーラミンO法およびアクリジンオレンジ法では充分な効果は得られない。これは、試薬組成と染色機構に起因するものと思われる。i液を35~40mLの電子レンジ対応プラスチックコプリンジャーに満たす。液温を70°C~65°Cにし電子レンジから取出す。スライドを2.の溶液に添加し、標本全体を均一に染色するように攪拌または浸漬し上下する。染色を完了させるために3~4分間、室温又は電子レンジ庫内で静置。(オーバーヒートしコプリンジャーからオーバーフローする可能性がある)。3~4分間スライドを2.の溶液で染色する。コプリンジャー2つにii液30~40mLを入れ、各1分30秒で替える。長い染色は蛍光染色を妨害する可能性がある。avium-intracellularを含むMycobacteriumは、濃い黒の背景に橙黄色の蛍光を発する。多数の棒状の生物が検出される。結核菌は、端部が丸みを帯びたわずかに湾曲又は直棒状。ロッドの長さは0.3~0.6μmである。培養に日数を要し、近年耐性菌株の出現が多くなったことより、薬剤耐性株を遺伝子検査から推定することが多い。リファンピシン耐性が広く多剤耐性(MDR)結核の指標マーカーとして使用されている。検査依頼時に遺伝子検査依頼を受けた場合は良いが、臨床医が予測していなかった結核菌の検出例や、耐性菌を疑っていなかったとき、もしくは検体採取が困難で検体量が極めて微量だったなどのケースでは、検体の保管管理がうまく伝達されず、必要なときに材料が手元に残って無いケースなどが多々ある。このようなときに一助となる方法として染色したスライド標本からDNAを抽出する方法がある20)。スライド標本からの遺伝子抽出は病理部門や遺伝子検査部門では比較的早期に導入された方法である。報告では、Z-N染色標本からDNAを抽出し、リファンピシン耐性のスポリゴタイピングを行っている。報文では、Z-N染色標本を用いているが、蛍光染色標本でも可能である。染色標本からの遺伝子抽出は標本を遮光乾燥保存しておけば数年単位の保管でも対応可能である。RNAの保管は厳しい要因が多い。感染試料を塗沫して作成した標本とブロックを薄切した標本とでは遺伝子の保存状態は大きく異なる。作成工程での断片化や汚染にも充分配慮すべきである。Z-N染色材料は滅菌蒸留水25μLを添加後、顕微鏡スライドから削り取る。サンプルを10分間、13,000×gで遠心分離。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、PCRに直接使用PCR増幅Z-N染色スライドからのDNA抽出物の10または2.5μLをPCRに使用する。Zandenらによって記載されたスポリゴタイピングのためのPCRを行う。geneから437-bpの増幅産物を得る。polymeraseを加温することにより非特異的アニーリングを回避した。glycosylaseを不活性化しDNAを変性する。96°Cで1分間の変性とプライマーアニーリング72°C—69°C(2サイクル毎に1°C落とす)、伸長は72°Cで1分間行う。続いて96°C・1分、69°C・1分、72°C・1分にて40サイクル増幅し、増幅産物は分析するまで-20°Cで保管する。sequencingで行った。526と531の塩基変異を調べた21)。System(ZYMO)が市販されている。蛍光染料について通常の蛍光真菌染色に使用する染料は蛍光増白剤や直接染料が一般的である。これらの染料は世界の化学メーカーから同一構造物や類似品が多くの名称で市販されている。これらの製品は工業分野への利用を目的に開発され、販売単位が大きいため検査室では試薬キットを使用することが多い。染色結果の考察には使用染料の特性を理解する必要があるので染料名の表記法の規定概要を示した。CAS番号とも呼ばれる)世界共通に用いられている。存在する場合に確実な染料同定の手段となる。C.I.)に収録され、名称および番号が与えられている。蛍光増白剤:蛍光能を持つ染料を蛍光染料もしくは蛍光剤という。目にする蛍光増白剤は白物衣料の増白効果を目的として、または製紙の白さ向上の表面加工時に用いられる。この蛍光増白剤が真菌のセルロースやキチンを染める染料として蛍光真菌染色剤に使用されている。染色では、指標物に染着するには指標物の分子と結合しなくてはならない。絹、羊毛はタンパク質からなるのでアミノ基(-NH2)と塩形成できるスルホ基(-SO3H)を有する染料が染着し易い。セルロースからなる綿はヒドロキシ基(-OH)と水素結合できるヒドロキシ基やカルボキシル基(-COOH)を持つ染料が染着し易い。臨床検査で馴染みが有るのはコンゴーレッドである。染料は分子自体が大きく、アゾ基をもつものが多い。グルカンとは真菌類(カビ、キノコ、酵母)の細胞壁はキチンやキトサン、β-グルカンなどが複雑に組み合わされてできている。この中でβ-グルカン(多糖類)は、D-グルコースがグリコシド結合で繋がったポリマーで、デンプン、グリコーゲン、セルロースなどの総称である。そのグリコシド結合様式によりβ-1,3-グルカン、β-1,6-グルカンに分けられる。一つのグルカンの中に結合様式の混在はあるが、α-様式もしくはβ-様式が混在することはなく、それぞれα-グルカン、β-グルカンと分けられる。出芽酵母の細胞壁の維持にβ-1,6-グルカンは不可欠であり、細胞壁に最も多いβ-1,3-グルカンやキチンや細胞壁タンパク質を結合する働きがある。真菌に特有の成分としては、β-グルカン、マンナン、ガラクトマンナンがある。蛍光真菌染色の指標物質であるキチンはムコ多糖の一種で、N-アセチルグルコサミンの1,4-重合物であるポリ-β1-4-N-アセチルグルコサミンのことである。構造はセルロースと類似しているが、2位炭素の水酸基がアセトアミド基になっている(図5)。溶解性に乏しく、ほとんどの溶剤に溶解しない。セルロースは、天然高分子で、β-グルコース分子がグリコシド結合で直鎖状に重合したβ-グルカンの一種である。細胞壁の構成は、子嚢菌や担子菌の多くはキチン-グルカンを主成分とし、接合菌ではキチン-キトサンを、出芽酵母ではマンナン-グルカンを主成分とする。開示されている主な染色液の一部を記載した。清浄なスライドグラス上に被検サンプルを置く。試料の上にカバースリップを載せ1分間置く。UV励起光の下で×100~×400の倍率で観察C:結果カルコフロールホワイト染色は、真菌や他の生物体の細胞壁に含まれるセルロースやキチンと結合する非特異的蛍光染料である。NaegleriaおよびBalamuthia種を検出する迅速な方法である。組織や細胞のバックグランド蛍光を減少させる。緩衝液pH7.0中のセルロースの最大蛍光は433nmである。綿繊維は強く蛍光を発するため真菌菌糸と区別しなければならない。分節の有無や形状、末端構造などにより区別できる。試料調整:標本またはスメアを1~5分間無水メタノールで固定する。スライドは、蒸留水または脱イオン水で洗浄した後すぐに染色できる。液を捨て、精製水で緩やかに水洗する。液を捨て、精製水で緩やかに水洗。スライドは、95%エタノール、無水エタノールと2回ずつ交換し脱水。515nm対比染色している場合は、赤のバックグランドに蛍光材料は緑Celluflourはさまざまな生物の細胞壁に見られるキチンやセルロースなどのβ架橋ポリサッカライドと非特異的に結合する。領域などが染色される。ケラチン、コラーゲンおよび弾性繊維も染色され診断のための構造的なガイドラインを提供する。GPフルオファンギー(コージンバイオ社)が市販されているがいずれも染料名は開示されていない。まとめここまで、臨床微生物検査で最も馴染み深い蛍光染色法について述べてきたが、これらは通常の可視染色法と蛍光染色法とで技法を二分するものではなく相補し、微生物検出の向上および検査作業の効率化を目指すものである。白癬菌の検査でも、KOH処理後の無染色標本および蛍光染色標本での検出率が比較されるが、この場合も処理時間、対象物(ツメや皮膚)の厚さ等により条件は異なる。真菌が組織表面に露出しているか深部に潜入しているかにより検出は異なる。落射式蛍光顕微鏡で観察する場合は、同様に薄い標本での検出は容易であるが厚い組織で底辺部に存在する場合の検出は容易ではない。画一ではない試料や状況変化に対して臨機応変に相補的に対応出来るように蛍光染色の技術と知識の研鑽が望まれる。