2台の含有のSUVを調製するための手順です。SRB-POPEの合成は、以前に20を説明しました。SRB-POPEを単一の20mLガラスシンチレーションバイアルに入れる。SRB-POPEストック溶液はクロロホルム溶液になる。精度のために、ピペットチップをクロロホルムで湿らせてから使用してください。安全のために、このステップは化学的なヒュームフード内で行うべきである。この混合物を窒素ガスの流れの中で化学的なフュームフード内で10分間、または溶剤が蒸発し、薄い脂質膜がバイアルの底に形成されるまで乾燥する。この混合物を10mTorrの真空強度で3h以上真空下で乾燥させて残留有機溶媒を除去する。注:3時間の乾燥時間は、このプロトコールに記載されているSUV調製のスケールに対して十分であり、これは50回の実験に適切である。大規模なSUV調製が必要な場合は、一晩の乾燥を行うことができる。NaCl、pH7.0)で希釈し、室温で30分間、35kHzの操作周波数で超音波浴に入れる。mLのベシクル懸濁液が得られます。溶液はピンク色/紫色で、比較的濁って見える。40°Cで液体窒素と水浴で小胞懸濁液を凍結融解して単層ベシクルを得る。凍結融解を10回繰り返す。注:(オプション)懸濁液中の非単層小胞が存在しないことを確実にするために、遠心分離工程32、33を適用することができます。小胞懸濁液を、脂質押出機を用いて0.10μmトラックエッチングされたポリカーボネート膜に押し出す(材料の表)をSUVのために豊かにする。押し出しを10回繰り返します。mLコニカルチューブを使用して押出小胞を集めることができます。溶液はこの段階では濁りがないはずである。34を形成するのに適しています。コニカルチューブをアルミホイルで覆い、使用するまで4°Cで保存します。4.マイクロ流体デバイスの組み立てPDMSブロックの入口および出口を、水洗瓶を用いて穴を通して脱イオン水を噴出させることによって妨害するように試験する。次に、PDMSブロックを窒素ガスで乾燥する。注:この手順では、チャネル内および/またはチャネル間に閉じ込められた可能性のあるほこりも取り除きます。必要に応じて、ダス​​ト粒子を除去するために、カバースリップを窒素ガスで予備洗浄した。/分の酸素流速、および200mTorrの真空強度で45秒間酸素プラズマを曝露する酸素プラズマシステム(材料の表を参照)サンプルチャンバ内のカバースリップ(セクション1を参照)。酸素プラズマ処理の直後に、PDMSブロックのパターン化された表面をカバースリップと接触させる。静かに押して、接触部位で気泡を除去する。接着を強化するために、デバイスを100°Cのレベルのホットプレート上に3分間置きます。kimwipe)を使用して、デバイスの上部(PDMS)および下部(ガラス)からほこりを取り除きます。次に、ガラス顕微鏡スライドの上にデバイスをテープで固定します。注:エタノールを過剰に使用したり、エタノールが入口と出口の流路に入らないようにしてください。装置が高温のときにこのステップを実行することは、エタノールが直ちに蒸発することを保証するために推奨されます。ガラス製マイクロレンズoscopyスライドは、100%エタノール溶液に保存して、ほこりや他の汚染物質を除去することができます。2含有SUV100μLを0.65mLのマイクロ遠心チューブに移す。N塩酸6.4μLを加えて溶液のpHを約3.2に調整する。注:マイクロpHプローブを備えたpHメーターで溶液のpHを確認します(材料の表を参照)。pH調整されたSUV溶液10μLを注入口から各チャネルに注入し、溶液が排出口に到達するまでピペットを介して圧力を加える。チップをピペットから取り外し、デバイスに取り付けたままにしておきます。各チャンネルについて上記のステップを繰り返し、室温で10分間インキュベートする。注:小胞のマイクロチャネルへの注入は、デバイスアセンブリの直後に行う必要があります。入口および出口管のセットを切断するそれぞれ60cm(入口管)および8cm(出口管)の長さである。注記:チューブを斜めに切断して鋭いエッジを作成すると、チューブをインレットとアウトレットに簡単に挿入できます。出口チューブは、円弧状でなければなりません。入口チュービングの長さは、顕微鏡のセットアップに基づいて変化し得る。配管の内径は0.05cmです。ピンセットを使用して、コンセントのチューブセットをデバイスに接続し、次にデバイスを顕微鏡ステージにテープで固定します。mLのランニングバッファーに入っているインレットチューブセットの一端を水中に浸し、テープでチューブが固定されていることを確認します。重力流を介してマイクロチャネルを通して溶液を押すために、円錐管を装置より高い地面(約20cm)に置く。これを達成するためにラボジャックを使用することができます。mLのランニングバッファーを吸引します。インレットからピペットチップを取り出し、入口管の自由端を装置内に挿入する。注記:このステップ中に気泡がチャネルに導入される可能性を減らすために、注入バッファーに注入バッファーを導入してください。インレットチューブを装置に取り付けたら、糸くずのないワイプを使用して余分なバッファーを取り除きます。上記の手順を繰り返して、すべてのインレットチューブピースをデバイスに接続します。注:チャネルを通って流れるバッファを流すことは、過剰な小胞を除去し、二重層を実験条件に平衡させるのに役立つ。顕微鏡コントロールソフトウェアを開きます(材料の表を参照)。"10X"目的を選択します。568"の画像アイコンをクリックします。微調整とコース調整ノブを使用して、マイクロチャンネルに焦点を合わせます。Closed"画像アイコンをクリックしてください。time]を選択します。露光時間を「200ms」に設定します。568」とマークされています)を選択します。次に、「時間経過」メニューをクリックし、時間間隔を5分に設定し、時間を30分に設定し、「開始」をクリックします。min)に基づいて、実行バッファー30μLを使用してチャネル内のSLBを平衡化します。8つのチャネルすべてに240μLのランニングバッファーを使用します。[測定]タブの下にある[サークル]ツールを選択し、任意のチャンネルに円を描きます。円が選択されている間、右クリックし、「プロパティ」を選択します。[プロフィール]タブの下にある[すべてのT]にチェックを入れて時間の関数としての蛍光強度。次のステップに進む前に、この曲線が平衡を示すプラトーに到達していることを確認してください。バッファー溶液を装置と同じ地面に下げて流れを止める。タイムラプスファイルを保存します。実行中のバッファーを希釈剤として使用してPHドメインの希釈液を調製する。注記:デバイスには8つのチャネルがあるため、ブランクコントロールには2つ以上のチャネルを使用してください。各側の遠端を選び、タンパク質希釈のために残りのチャネルを使用する。以下のPHドメイン濃度を試験した:0.10,0.25,0.50,1.00および2.50μM。約200μLの各希釈液で30分以内に平衡に達しました。一度に1つずつ、各アウトレットチューブを外し、各タンパク質希釈液200μLを出口チャネルはピペットを使用します。圧力をかけないで、重力が仕事をするようにしてください。チップをピペットから取り外し、マイクロ流体デバイスに取り付けたままにしておきます。各チャンネルについて上記の手順を繰り返し、このプロセス中に気泡がチャンネルに導入されていないことを確認します。インレットチューブをマイクロ流体装置の下の地面に下ろして、マイクロチャネルを通してタンパク質を流し始める。配管の自由端を廃棄容器に貼り付けます。タンパク質希釈液を30分間流す。注:これは流れを逆転させ、タンパク質がチャネルに導入されるようにします。平衡までの時間および必要とされるタンパク質希釈の量は、相互作用の親和性に依存する。"Start"をクリックしてイメージングをもう一度開始します。ステップ5.15を繰り返して、平衡に達していることを確認します。実験が完了したら、時間の経過を保存するファイル。注:光漂白後の蛍光回収(FRAP)実験は、SLBが液体であることを確認するために、新しい各バッチのSUVおよび清浄なガラスカバースリップで行う必要があります。ガラスカバースリップ(1.1-1.6)の洗浄、マイクロパターン化PDMSブロックの製作(2.1-2.5)、SUVの調製(3.1-3.8)、マイクロ流体装置の組み立て(4.1-4.5)およびSLBの形成(5.1-5.17)記載されている。msに設定し、ビニングを1に設定します。532nm、2mWのレーザービーム(半径13μM)を使用して、円形のスポットを光漂白する。光退色の直後に、最初の45秒間に3秒ごとに一連の画像をキャプチャし、残りの時間(合計15分間)の間に30秒間隔で撮影を開始します。データ収集が完了したら、時間経過ファイルを保存します。漂白剤を選択してください円描画ツールを使用して時間の関数として蛍光強度値を抽出する。近くにさらに2つの領域を選択します.1つは未漂白領域に対応し、もう1つはSLBがない領域に対応します。iは漂白前の蛍光強度を表す(この場合、正規化された値として「1」を使用する)。FRAP曲線を生成するために時間(x軸)の関数として蛍光回復(y軸)をプロットする。)を計算するために使用される。)を計算する:注記:ここでRはレーザービーム半径(13μm)を表します。ソフトウェア、および使用されているカーブフィッティングソフトウェアに依存します。PHドメインを滴定する前(ステップ5.17から)および後(ステップ6.6から)の時間経過ファイルを開く。スプレッドシートソフトウェアにデータを転送します。注:ブランクチャネルの蛍光強度は変化していないはずです。他のすべてのチャンネルはブランクチャンネルに標準化されているので、2つのブランクチャンネルを持ち、蛍光強度が互いに一致していることを確認することが重要です。下の公式を適用して空のチャンネルにデータを正規化します。図7Bにサンプル計算が提供される。)を用いて、蛍光強度はPHドメイン濃度の関数として減少するので、正規化されたデータは値が負である。50%の被覆率(バルクのタンパク質濃度([PLC-δ1のPH])に等しい、見かけ解離定数を表し膜結合複合体)が達成される。d、appを抽出する。2相互作用を研究するためにpH調節アッセイを使用した。)、PIP含有SLBへのタンパク質結合のテスト方法を示しました。典型的なSLB結合実験のフローチャートを図4に示す。2結合を用いて図5に示す。2含有SLBに結合することを示唆した。具体的には、結合すると、局所pHがより基本的になることが観察された。