ホスホイノシチド相互作用を研究するためのマイクロ流体プラットフォームの文脈で、支持された脂質二重層を提示する。here.Abstract数多くの細胞タンパク質が膜表面と相互作用して必須の細胞プロセスに影響を与えます。これらの相互作用は、ホスホイノシチド(PIP)の場合のように、特定の細胞内局在および/または活性化を確実にするために、膜内の特定の脂質成分に向けられ得る。PIPおよび細胞PIP結合ドメインは、細胞生理学におけるそれらの役割をよりよく理解するために広範に研究されている。本発明者らは、タンパク質-IPP相互作用を研究するためのツールとして、支持された脂質二重層(SLB)上にpHモジュレーションアッセイを適用した。-スルホローダミンB結合ホスファチジルエタノールアミンを用いてタンパク質-PIP相互作用を検出する。局所pHの変化)、プローブのプロトン化状態がシフトする。)相互作用を例として示す。d、app値と同様に、0.39±0.05μMであった。2特異的であり、ホスファチジルイノシトール4-リン酸に対するより弱い結合を示し、純粋なホスファチジルコリンSLBへの結合は示されない。改善された信号対雑音比。したがって、PIP-on-a-chipアプローチの使用は、広範囲の膜相互作用のメカニズムの解明を容易にするであろう。この方法は潜在的にu膜と相互作用するタンパク質の能力を調節する治療薬を同定することには魅力的である。Introduction無数の相互作用および生化学プロセスは、二次元的に流体の膜表面上で起こる。真核細胞における膜封入オルガネラは、生化学プロセスおよびそれらの関連プロテオームだけでなく、それらの脂質組成においてもユニークである。例外的な種類のリン脂質の1つはホスホイノシチド(PIP)である。それらは細胞リピドームのわずか1%を占めるにもかかわらず、それらは他の1、2、3、4間の信号伝達、オートファジー、および膜輸送において重要な役割を演じます。トリス-リン酸化5を生じます。N末端相同性(ENTH)6、7。2)と相互作用-δ1PHドメインであります、9、10、11。種々の定性的および定量的インビトロ法が開発され、これらの相互作用の機構、熱力学および特異性を研究するために使用されている。PIP-ストリップ)12、13。これらは広範囲に利用されていますが、それらには多くの欠点があります。SPR、ITC、およびNMRは、サンプル、高価な計測機器、および/または訓練された人員12、13を大量に必要としています。そのような抗体ベースの脂質ブロットのようないくつかのアッセイ形式は、のPIPの水溶性形態を利用し、非生理的方法12、14、15、16にそれらを提示します。脂質ブロットは確実に定量することができないと、彼らは多くの場合、偽陽性/陰性所見12、17、18をもたらしました。これらの課題を克服し、現在のツールセットを改善するため、サポートされている脂質二重層(SLB)に基づいて新しいラベルフリーの方法が確立されました。タンパク質-PIP相互作用を検出するために使用される戦略は、pH調節感知に基づく。SRB)を有するpH感受性色素が関与する。図5B)内を6.7のpKaを有する高pHでクエンチします。2への結合を試験するために使用することができると推論した。p>この研究では、マイクロ流体プラットフォーム内のPIP含有SLBへのタンパク質結合を行うための詳細なプロトコールが提供される。このプロトコルは、読者に、マイクロ流体デバイスおよび小胞調製物をSLB形成およびタンパク質結合に組み立てることを要する。2相互作用の親和性情報を抽出するためのデータ分析のための指示が提供される。注記:このソリューションは熱くなります。身体からの怪我を避けるために注意してください。7x洗浄液は、六ナトリウム[オキシド[オキシド(ホスホナトオキシ)ホスホリル]オキシホスホリル]ホスフェート、2-(2-ブトキシエトキシ)エタノール、1,4-ビス(2-エチルヘキソキシ)-1,4-ジオキソブタン-2-スルホネートおよび非有害な添加物を含む。mm)を交互に配置します。彼らがお互いに触れるのを防ぐために各カバースリップの間に空の場所を保つ。汚れラックに洗浄液のカバーガラスを完全に浸してください。カバースリップを溶液を1時間インキュベートする。注:水が蒸発するにつれて、新鮮な脱イオン水を加え続けて、溶液の濃度を変えないようにしてください。汚れラックを洗浄液から取り出し、大量の脱イオン水でカバースリップを洗って洗剤を除去する。カバースリップを窒素ガスで乾燥させ(約5分/染色ラック)、カバーガラスを550°Cで6時間キルン中に置き、アニーリングする。注:これは、ガラス表面の粗いフィーチャーを滑らかにする重要なステップです。カバースリップをプラスチック容器に入れ、埃から遠ざけてください。w)の割合で大型のプラスチック製の秤量ボートに混合し、500Torr以下の真空強度で1時間減圧脱気する。注:PDMSは透明で不活性なシリコーンポリマーです。所望のPDMSブロックtを得るために(0.5cm)に入れ、55gのプレポリマーを5.5gの硬化剤と混合する。同一のSU-8マイクロパターンの複数の複製を含むシリコンマスターを大きな(10cmベース直径の)プラスチック製の秤量ボートに入れ、脱気したPDMSに注ぐ。その後、60°Cの乾燥オーブンで一晩中硬化させます。注:マイクロパターンは肉眼で見ることができる大きさです。硬質焼成SU-8フォトレジストからなるシリコンウェハ型をナノ加工設備27で製作した。マスターを調製するための他のアプローチは、フッ化水素酸(HF)エッチング、高温水エッチング、xurography、及び3Dは28、29、30、31の印刷を含みます。Commercシリコンマスター調製のための原料も使用することができる。マイクロ流体デバイスのパターンは、製図ソフトウェア(材料表を参照)を用いて設計された。Design.dwg"として提供され、メーカーに直接提供することができます。静かに、PDMSをシリコンマスターから手で剥がします。外科用メスとルーラーを使用して、矩形内の各マイクロパターンの境界をマークします。次に、PDMSをブロックに切断します。図3Bに示すように、生検パンチ(穴径1.0mm)を用いて、各マイクロチャネルの両端に16穴(ブロック当たり8つの入口および8つの出口)を突き刺す。各PDMSブロックにテープを貼り、マイクロパターンを損傷や埃から保護します。それらをプラスチック容器に保管してください。