RNA-seq解析とは近年の急速な分析技術の進歩により、細胞や分子の性質を、集団の平均値としてではなく、一つひとつの細胞や分子の個性を維持したまま解析することが可能になりました。シングルセルRNA-seq解析では細胞集団の転写産物を1細胞ごとに網羅的に解析します。そのため、細胞集団を構成する細胞がどう分類できるかが未知のままでも、細胞集団を亜集団にクラスタリングして特徴を抽出することが可能です。平均値の解析(通常のRNA-seq解析)では他の大多数の細胞のシグナルに埋もれて検出が困難な、希少細胞における発現変化も検出可能です(解析例2参照)。(DEG)の抽出を行いました。cellsPCA(主成分分析)により、高次元のデータ(ベクトル)である発現プロファイルを、情報のロスを極力抑えつつ低次元に変換しました。クラスタリング結果をUMAP*2により二次元上にプロットしました。cellsPCA(主成分分析)により、高次元のデータ(ベクトル)である発現プロファイルを、情報のロスを極力抑えつつ低次元に変換しました。クラスタリング結果をUMAP*2により二次元上にプロットしました。各クラスタの発現変動遺伝子(Heatmap)各クラスタの発現変動遺伝子(Heatmap)各クラスタで特徴的な遺伝子をヒートマップを用いて可視化しました。横軸は各クラスタに、縦軸は遺伝子に対応しています。発現量が多い遺伝子は赤色、少ないものは青色で示しました。各クラスタに特徴的な発現変動遺伝子の一部を列挙しました。RNA-seq解析では、細胞集団の組成に関する事前情報なしにクラスタリングし、特徴的な遺伝子の発現変化を抽出する事ができます。特徴的な遺伝子の発現分布を図示しました。クラスタに特徴的な遺伝子、複数のクラスタで高発現している遺伝子を視覚的に確認できます。この様な発現プロファイルやその他の解析をもとに、各クラスタの細胞種を推定しました。sequenceを行ったデータを解析しました。WTとKOにおける発現変動遺伝子(DEG)の抽出を行いました。effect)を排除しながら発現プロファイルの次元削減を行い、クラスタリング結果をt-SNE*3により可視化しました。左図はWT、KO毎に、右図はクラスタ毎に図示しました。マーカー遺伝子、GO解析等の機能解析結果より総合的に判断し、各クラスタの細胞種を推定し図示しました。AがKOマウスの表現型の異常に関与すると推定された細胞種です。野生型とノックアウトにおける発現変動遺伝子の発現分布の一例WTとKOにおいて、発現変動した遺伝子の一部を図示しました。Aでは、複数の遺伝子に顕著な発現変動が確認できました。これらの発現変動遺伝子の一部はKOマウスの表現型に深く関わっている可能性が考えられます。RNA-seq解析では、細胞集団のわずか数%の細胞でしか起こっていない変化を鋭敏に検出することが可能です。T細胞のシングルセルRNA-seqデータを使用して4,721細胞のクラスタリングを行いました。cells)PCA(主成分分析)により発現プロファイルの次元削減を行い、クラスタリング結果をt-SNEにより可視化しました。A)を発現していました。各クラスタに特徴的な遺伝子発現ヒートマップ(Heatmap)各クラスタに特徴的な遺伝子発現ヒートマップ(Heatmap)各クラスタに特徴的な遺伝子の発現をヒートマップで一覧表示しました。PDCD1(PD-1)などが発現していました。clustering)した後で、その細胞の性質を解析出来ます。由来組織を色分け表示(図上部、末梢血:緑、正常組織:青、腫瘍組織:赤)すると、C5のほとんどは腫瘍組織由来でした。al.)の発現量と、ランダムに選択した遺伝子群の発現量の差分をスコアリングして可視化しました。スコアが高い(赤色で表示)細胞ほど、疲弊したT細胞の特徴を有していると考えられます。C5が最も高いスコアを示しました。ごとに各クラスタの構成比率を見ると、C5は末梢血(PB)や正常組織(Normal)にはほとんど見られず、腫瘍組織(Tumor)浸潤T細胞に多く含まれていました。この様に、細胞の分類基準や組成が分かっていない状態で細胞を分類し、解析対象(病態モデルやノックアウトなど)に特徴的なクラスタを見出すことが出来ます。FOXP3CD4を発現するT細胞(C0,C1,C2,C6,C8,C9)のうち、C2には制御性T細胞(Treg)で特徴的に発現するFOXP3の発現が見られました。plotによるC2の発現変動遺伝子の可視化FOXP3を発現しているC2とそれ以外のCD4+T細胞の遺伝子発現を比較し、発現変動比と統計的有意差をボルカノプロットで図示しました。TNFRSF9などの発現量が有意に高い(グラフ右上)ことが示されました。C2)の割合が顕著に増加していました。マウスES細胞の擬時間(pseudotime)解析ES細胞(胚性幹細胞)にレチノイン酸を添加して分化を誘導し、経時的に細胞を回収してシングルセルRNA-seqを行ったデータを使用し、ES細胞分化の経時的変化を解析しました。96時間後に採取したマウスES細胞をクラスタリングし、t-SNEにより二次元表示しました。多様な分化状態の細胞からなる細胞集団をC1-C7の7クラスタに分類出来ました。主成分分析(PCA)による次元削減後の発現プロファイルの類似度に基づいて推定された擬似的な時間(pseudotime)の軸に沿って細胞を配置し、クラスタ毎に色分け表示しました。推定した擬時間軸に沿って配置した細胞を、クラスタ毎に表示しました。各クラスタは擬時間軸に沿って連続的に分布していました。推定した擬時間軸に沿って配置した細胞を、分化誘導後の採取時間ごとに表示しました。擬時間の経過(擬時間軸上での位置変化)と、実時間経過(試料採取時間)はよく対応していました。多様な分化状態を含む細胞集団の発現プロファイルを取得して、この様な解析手法を用いることにより細胞の分化過程を推定できると考えられます。RNA-seqを行ったデータを使用して解析を行いました。cells)PCAによる次元削減後に細胞のクラスタリングを行い、t-SNEにより二次元上に可視化しました。右図はクラスタごと、左図はFACS分取した由来細胞種ごとに色分け表示しました。腹水より採取された樹状細胞およびマクロファージは単球由来であることが示されており、これらの細胞の発現プロファイルを用いて分化経路推定を行いました。cellPCAによる次元削減後に細胞のクラスタリングを行い、t-SNEにより二次元上に可視化しました。右図はクラスタごと、左図はFACS分取した由来細胞種ごとに色分け表示しました。腹水より採取された樹状細胞およびマクロファージは単球由来であることが示されており、これらの細胞の発現プロファイルを用いて分化経路推定を行いました。ordering)、二次元に可視化しました。左図はクラスタごと、右図は擬時間に従って細胞を色分け表示しました。cell擬時間変化に伴って発現量が変動した遺伝子を網羅的に抽出し、各遺伝子の発現量をヒートマップ表示しました。cellに分化する方向に擬時間経過を表示しました。macrophageマーカー遺伝子を抽出し、擬時間経過に伴う発現量変化をプロットしました。縦軸は発現量、横軸は擬時間経過、着色された各点は個々の細胞を示しています。擬時間は、始点を0、それぞれの経路の終点を100として表示しました。cell側、点線がmacrophage側に分岐した細胞での発現量変化を示しています。macrophageマーカー遺伝子の発現量変化をプロットしました。各マーカー遺伝子の擬時間経過に伴う発現増加が確認できます。velocity解析による細胞動態の推定げっ歯類の切歯は生涯伸び続けることが知られています。これはげっ歯類の切歯の根元に存在する幹細胞が、歯のエナメル質を形成するエナメル芽細胞を継続的に供給していることによります。velocity解析により、切歯基部の細胞動態を解析しました。cells)エナメル芽細胞と前駆細胞を含むマウス切歯基部の上皮細胞をクラスタリングしました。PCAにより発現プロファイルの次元削減を行い、クラスタリング結果をUMAPにより二次元上に可視化しました。(3次元プロット)クラスタリング結果をUMAPにより三次元上に可視しました。直感的にクラスタリング結果を確認することが可能です。※プロットをドラッグして回転、マウスのホイールで拡大、縮小が可能です。クラスタリング結果をUMAPにより三次元上に可視しました。直感的にクラスタリング結果を確認することが可能です。※プロットをドラッグして回転、マウスのホイールで拡大、縮小が可能です。前駆細胞はゆっくりと細胞周期が進行していること、エナメル芽細胞は切歯の近位から遠位に向けて分化が進むことが知られています。S期およびG2/M期に特徴的な遺伝子と、エナメル芽細胞に特徴的な遺伝子の発現分布を示しました。velocity解析により細胞動態を解析しました。矢印は状態変化の方向と大きさを示します。Chromiumシステムで実施します。ご依頼の解析内容により異なりますので、詳細はこちらよりお問い合わせください。サービスの流れこちらをご覧ください。ご注文方法こちらよりお問い合わせください。受入物を品質検査した結果、解析をお引き受けできない場合があります。基礎から学べる訪問技術セミナー(無料)を開催中です。開催をご希望の方はこちらよりご連絡ください。データにより解析できない場合があります。Genomics社の登録商標です。C1システムは、Fluidigm社の登録商標です。Bio社の登録商標です。Laboratories社の登録商標です。