Abstract骨髄系樹状細胞のTLR3を介したシグナルは、IFN-α/βやIL-12p70産生、NK細胞活性化、CTL誘導などの細胞応答を誘起することから、TLR3リガンドのdsRNAはがんや感染症ワクチンにおける有望なアジュバント候補となっている。合成dsRNAのpoly(I:C)は、細胞外からエンドソームTLR3と細胞質MDA5の両経路を活性化しシグナルを伝達することから、dsRNAの細胞内への運搬とシグナルは時空間的制御を受けると考えられる。本研究では、細胞外のdsRNAの取り込みと細胞内dsRNAセンサーへの配送機構およびシグナル伝達の時空間的制御を明らかにするため、TLR3経路のみ活性化する新規TLR3リガンドの開発を行った。TLR3のリガンド認識機構を考慮し、28種類のRNA誘導体を合成した。マウス骨髄系樹状細胞によるサイトカイン産生について検討した。X)を得ることに成功した。poly(I:C)同様、Raftlin依存的エンドサイトーシスで細胞外からエンドソームTLR3に運ばれる。TLR3―TICAM-1を介してIFN-β産生を誘導する。細胞質RIG-I,MDA5経路を活性化しない。マウス生体内投与での炎症性サイトカイン産生量はpoly(I:C)投与より少ない。細胞外からTLR3のみを活性化できるRNA誘導体はこれまで報告がなく、今回の化合物がはじめてである。Xはアジュバント研究のみならず、シグナル解析においても有用なツールとなる。planned.Reason1.新規RNA誘導体の構築が、申請者らのこれまでの研究成果を基に行われている。2.TLR3リガンドをスクリーニングするための知識、材料を保有しており、方法を確立している。3.申請者らの研究室で、アジュバント効果の評価系の確立を行っている。KOを作製し維持している。Activity今後の研究の推進方策は以下の2点に集約される。dsRNAによるアジュバント効果に必須のシグナル経路を同定する。MDA5両シグナル活性化)によるアジュバント効果を、マウス移植がんモデルを用いて査定する。EG7など)を用いる。MDA5経路いずれが重要であるか調べる。Raftlin-2のノックアウトマウスを作製しアジュバントの取り込みが活性に与える影響を明らかにする。細胞外RNAの取り込みレセプターを同定する。Xの細胞内取り込みに必須の分子Raftlinは細胞膜で取り込みレセプターと相互作用すると考えられるため、Raftlinを用いた共免疫沈降法で取り込みレセプターの同定を行う。具体的には、C末に2種類のtagをつけたRaftlin分子をHEK293細胞あるいはHeLa細胞に強制発現させ、poly(I:C)刺激後tag抗体でタンデムアフィニティー精製し質量分析でRaftlin結合分子を同定する。小布施研究室と共同で行う。FundingdsRNA取り込み機構の解析から、ヒト細胞ではRaftlin分子がpoly(I:C)の取り込みに必須であるがマウスではRaftlin以外にRaftlin-2が関与することが示唆されたため、平成23年度内にRaftlin-2ノックアウトマウスの作製を着手する予定であったが、ES細胞の質が悪く順調に進まなかった。平成24年度のノックアウトマウス作製費として使用予定である。