Achievements平成30年度では、歯髄幹細胞(DPSC)の集合体を血管内皮細胞へ分化誘導することによる血管系細胞への分化過程について検討した。マーカーであるSMA陽性細胞からなる明瞭な網目状構造が形成されていることが分かった。次に、細胞集合体内に形成された網目状構造について詳細な検討を行うことを目的として、VE-difで20日間培養した細胞集合体に蛍光色素を含有したデキストラン粒子を流し込んだところ、細胞集合体に形成された網目状構造に一致するデキストラン粒子の沈着を認めた。このことは、SMA陽性細胞によって形成された網目状構造が管腔様構造であることを示しており、細胞集合体内で血管内皮細胞に分化したDPSCが毛細血管様の構造を形成しているものと考えられた。内層を構成する細胞を取り出し、CXCL1やVEGFAなどの血管内皮細胞分化マーカー、および幹細胞マーカーであるNanogのmRNAの発現をリアルタイムPCRによって検討した。その結果、最大20日間の培養期間において、CXCL1とVEGFAは、集合体外層を構成するDPSCで内層の細胞と比較して有意に多く発現していることが分かった。NanogのmRNA発現量は、培養10日目までにおいて集合体内層の細胞で有意に多く発現していたが、培養20日目では、内層と外層の細胞で有意差はみられなくなった。以上のことから、DPSCからなる細胞集合体をVE-difで培養することで、集合体外層のDPSCが血管内皮細胞に分化し、毛細血管様構造を形成したことが明らかとなった。(VE-dif)で培養することで、集合体内に毛細血管様の網目状構造物を形成できることが示された。分化することを明らかにした。これらの結果は、DPSCを用いて作製した細胞集合体をVE-difで培養することで、血管網をもった歯髄様組織を創製できる可能性を示している。以上のことから本研究は、おおむね順調に進展していると判断できる。Activity細胞集合体を構成する歯髄幹細胞を神経細胞へ分化誘導することで集合体内に構築される神経網構造の形成過程を観察し、また神経細胞へ分化した歯髄幹細胞の分布を評価する。作製し、その歯髄再生能を評価する。具体的には、以下の研究計画を実施する。用いて最大20日間培養後、パラフィン包埋薄切切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を行うことで神経網が形成される過程を経時的に観察する。内層を構成する細胞を取り出し、NestinやGFAPなどの神経細胞分化マーカー、および幹細胞マーカーであるNanogのmRNAの発現をリアルタイムPCRによって検討する。vitroで作製する技術を確立することを目的として、作製した歯髄幹細胞集合体に対して血管内皮細胞と神経細胞への段階的分化誘導を行う。作製した人工歯髄様組織内における分化した各細胞の分布については,各細胞分化マーカーの多重免疫蛍光染色により評価し、さらに、各細胞の割合をフローサイトメトリーにて定量する。作製した人工歯髄様組織内の血管網機能はデキストラン粒子を用いる手法で、神経機能はカルシウムイメージング法を行うことによって評価する。歯髄再生医療に有用であるかを明らかにする。