会社概要ごあいさつ採用情報アンプリコンシーケンス解析のサンプル調製についてアンプリコンシーケンス解析サンプル調製について弊社ではアンプリコン調製に2段階PCRを用いております。1stPCRでは、増幅対象遺伝子と相補鎖を形成する配列+MiSeqでの解析に必要な共通配列の一部を含んだプライマーを用います。2ndPCRでは、MiSeqでの解析に必要な共通配列とサンプル識別を行う為のMID配列でデザインされたプライマーを用います。2ndPCRでは、1stPCRで得られた増幅産物の両末端にある共通配列とプライマーが相補鎖を形成します。2ndPCRは解析対象遺伝子の配列に依存しません。解析対象遺伝子を変える場合でも、1stプライマーのForward/Reverse一組を新たにデザインするだけでよく、2ndPCR用プライマーは使い回しができます。弊社では、8サンプルが識別できる2nd用プライマーを1セットとして、多数のお客様のサンプルを同時解析できるように複数のセットを常時ストックしております。弊社でのMiSeq利用をご検討しておられるお客様にはプライマーを1,500円(税別・送料込)で提供しております。1stPCR用のプライマーセットについても、解析対象遺伝子と相補鎖を形成する配列をご連絡いただければ、無償で合成いたします。(おおよそ500bp以下)※個別対応させていただきます。自社で開発したプライマーでの解析です。PCR用のプライマー配列です。PCR用のプライマーとの相同部分、後半が16SrRNAとの相同部分です。各ステップの詳しい情報については、以下をご確認ください。テンプレートDNAについて経験上1~5ng程度のDNA量を推奨しております。DNA抽出については市販のDNA抽出キットをご利用していただければ問題ございません。SPINを中心として数種類のキットをサンプルに応じて使用しております。PCRのサイクル数を上げすぎると非特異的な増幅(ネガティブコントロールでも増幅してしまう)が起こってしまう可能性がございます。各遺伝子のPCR条件詳細については下記でダウンロード可能です。V3V4ITS1(ITS1F_KYO1-ITS2_KYO2)ITS2(gITS-ITS4)18S(真核生物)MiFish(環境DNA/魚類)COICOI(ブロッキング有)PCR産物の精製について2ndPCRに用いるプライマーはMiSeqでの解析(SBS法)に必要な配列を含んでおります。MiSeqでの解析時に2ndPCRに用いるプライマーが含まれていると、2ndPCR用プライマーが優先的に解析されてしまい、データの取得が困難となってしまう可能性がございます。PCR産物精製で最も重要なのはプライマーの除去です。カラム精製でも問題ないと判断しておりますが、経験上ビーズ精製を推奨しております。品質検定と濃度測定を行います。測定の結果、プライマーの混入等の解析対象以外のピークが確認され、MiSeqでの解析に問題があると判断した場合、弊社でビーズ精製を行います(有償:5,000円)。場合によっては解析を中止させていただく場合もございます。使用した16S全長アンプリコン解析サービスの一時休止について12.162019ステリベクスインキュベーション用ハイブリオーブン12.162019年末年始のお休み最近のブログ2020.2.13大野さん食堂10月に開始してから毎週木曜日は大野さん食堂です。予定通りミズアブ御飯を作りました。2020.2.9BSFプロジェクト年度末繁忙期でブログのネタがありません。BSFプロジェクトのネタをアップします。