大統領選に敗れた後、1914年2月にルーズベルトは従来より興味を持っていたアマゾン川流域の探検に乗り出した。直接の目的はアマゾン川最大の支流、マデイラ川の奥地にあるとされた「謎の川」(ドービト)の調査にあったが、彼の趣味である博物目的の狩猟も兼ねていた。ビト川の調査自体は成功(後にブラジル政府により、河川名として彼の名前が冠された)したものの、探検の責任者であったカーンジト・ロンドンの補給に対する認識の甘さによる物資不足、急流や滝などに阻まれる川下りの困難さに直面し、数名の犠牲者を出し、ルーズベルト自身もマラリアに罹患、探検後半は動けなくなるほど衰弱し、ボートで寝ているしかなかった(他の隊員に迷惑をかけてしまった)自分自身を嘆き自殺まで考える程の苦難の探検となった。探検前からあまり良好とは言えなかった彼の健康状態を決定的に悪化させたのがこの探検である、と推測する歴史家も多い。彼は帰国後探検手記を出版したが、その中で印象的に描かれていた「アマゾンの獰猛な肉食魚」ピラニアの知名度をアメリカ人の中で上げるきっかけともなった。