改訂ここではN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)を用いたクロロフィル抽出法および定量方法についての説明を行います。はじめにDMF抽出法はクロロフィルの定量方法としては,アセトン抽出法と並ぶ,一般的な方法である。アセトン抽出法は,サンプルを粉砕しなければならないのに対しDMFはintactなままのサンプルから抽出できることから,初心者でも信頼できる結果を出すことができる。クチクラ層の発達した厚い葉ではDMFが細胞に浸透しないために抽出が難しい。そのような場合はアセトン抽出法を選んだほうがよい。測定全体の流れ単位葉面積あたりのクロロフィル量を求めるため、定量は次のような流れで行う。以下、各項目について順番に説明する。discを定量に用いる。決まった面積であればどのように切り抜いても構わない。discを抜くことができる。リーフパンチは使用の度にきちんと穴とパンチ部がはまるかどうかを確認してから使用する。1枚の葉(もしくは同じような状態の葉)から3〜4枚切り抜く(これが1セット)。区別)を記入しておく。disc内に入らない様に注意する(1セット内の状態が同じであれば良い)。discにする必要はない。定量に用いる葉の葉面積を測定する。(葉面積測定方法を参照のこと)なお,定量に用いるサンプルは-30°Cであれは半年ほど,-80°Cであれば数年は保存することができる。冷凍保存したサンプルは一度解凍してしまうと細胞が壊れてクロロフィルの分解が始まるため,速やかに抽出・定量を開始する必要がある。実験前の準備この方法で用いるDMFは体の表面から吸収されやすく,気化したものを吸い込むと肝臓に傷害を与えるおそれがあるため,十分に注意して行うこと。基本的な実験器具・機器の扱い参照のこと。抽出に用いる試験管に,サンプルのIDを油性ペンで記入。油性ペンのインクもDMFに溶けるため,試験管の口から離れた位置に書く。試験管を封する際に使うパラフィルムは予め必要な枚数を切っておく。ml(サンプルの大きさによっては臨機応変に変えること)を試験管に注ぐ。DMFは気化しやすいので,オートビュレットを使用すると便利。disc(もしくは葉)を入れ,素早くパラフィルムで封をする。disc(もしくは葉)が液の中にきちんと入ったかどうか確認する。DMFを入れて封をした試験管は試験管立てごとアルミホイルでしっかりと覆い光が当たらない様にして冷蔵庫に入れる(クロロフィルの分解を防ぐため)。1-3日静置するとサンプル中のクロロフィル・カロテノイドがDMFに抽出されるため定量を行う。※抽出にかかる時間はサンプルによって異なる。測定波長DMFに抽出されたクロロフィル,カロテノイドの吸収がある波長は下記の通り。nmの吸光度を分光光度計を用いて測定する。測定の際,可能であれば分光光度計もドラフトチャンバー内に置いて測定を行うことが望ましい。基本的な操作は分光光度計の扱い方参照のこと。分光光度計は,あらかじめドラフトチャンバーの中に設置して電源を入れておく。測定値を記録する用紙を準備して手元に置いておく。上述の4波長の吸光度を測定する。一般に下記の式により計算される。一般によく引用される式。クロロフィルについては上記をμg/mlにしたもの。nmで測定された吸光度を引いた値を示す。a+bを計算で求める。a+bを葉面積あたりの量(分子量または重さ)に変換する。後片付け「遠足は,お家に帰るまでが遠足です。抽出に用いたDMFおよびその2次洗浄液は下水などに流すことが禁じられており,予め用意した廃液用のポリタンクに保管し,各研究機関の規定に従って処理する。抽出に用いた試験管は水道水で2回以上ゆすぎ(ゆすいだ後の水も廃液タンクに保管),その後,洗剤を使って洗浄,5回以上水道水ですすいだ後,蒸留水ですすぐ(これらの水は下水に流してよい)。