cell)療法の技術革新と臨床応用は目覚ましい。臨床応用が先行しその作用機序の解明が未解決な点など、残された課題も多い。本応募研究では、革新的イメージングシステムの構築、CAR-T細胞のシグナル伝達経路の可視化、CAR-T細胞のがん細胞傷害機構の解明、細胞内シグナル伝達分子を導入した新たなCARの設計を行い、より高い殺傷機能と容易な活性調節機構をもつ次世代CAR-T細胞の創出を目的とする。CAR-T細胞の抗原認識と活性化、がん細胞傷害活性の分子メカニズムを解明する。その結果からTCR下流の細胞内シグナル伝達分子を導入したCAR-T細胞キメラ受容体を作製し、より強力ながん細胞傷害活性を持ち、一方で傷害活性の調節が容易であり、かつ安全な細胞治療が期待できる新規CAR-T細胞の開発基盤を作る。vivo細胞傷害活性の検証、を予定している。CAR-T細胞およびHLA-A2とがんペプチド抗原を認識するTCR-T細胞の分子イメージングの実験系を構築し、それぞれのCAR/TCR-T細胞の細胞殺傷効果をCAR/TCRの1分子イメージング解析によって評価し、より効果的なCAR/TCR-T作成の分子基盤を創出する。(プレイナーメンブレン)を構築した。TCR-OT-Iハイブリドーマとプレイナーメンブレンとの接着面にも可視化された。その際にCARのみならず自己抗原を提示しているMHC分子とCAR-T細胞に発現している内在性TCRが結合することで、その内在性TCRがマイクロクラスターとして凝集する現象を発見し、CARと内在性TCRとのクロストークの可能性とそれによるCAR-T細胞の活性化惹起に関する分子機構を見出した。これは自己ペプチドに反応するTCRを明確に示した最初の実験と考えている。上記分子イメージングによってCARマイクロクラスターにもTCR/CD3下流で機能しTCRとMHC抗原ペプチドとの結合によりTCRマイクロクラスターに会合してくるシグナル伝達分子およびチロシンリン酸化分子の一過性のリクルートを明らかとなり、CARを構成しているCD3zeta鎖とCD28細胞内ドメインがTCRマイクロクラスターと同等のシグナルソーム形成に寄与することを証明した。Malcolm博士と議論を重ねながら進めている。TIRFMを用いて、CARの1分子イメージングを行った。その結果、TCR/CD3の初期のリン酸化に重要なLckがCARマイクロクラスターとインターラクションしている現象を可視化することができた。Activity新規CAR-T細胞受容体に会合するシグナル伝達分子の検証:アダプター分子として用いたa)SLP-76、b)LAT、c)CARMA-1のさらに下流のシグナル伝達分子が、それぞれの分子やそのドメインに対応してどの程度増幅されているか、1)生化学的方法、2)イメージングによるクラスター形成の増強、の二方向から検証する。SLP-76の下流のシグナル伝達分子でもあり受容体のクラスタリングにも寄与するアクチン重合関連分子WASP、ADAP、Arp2/3、アクチンを指標として、Inside-outシグナルの増強を判定すると共に、ノックダウン細胞を用いてそのInside-outシグナルの減退を確認する。E3ユビキチンリガーゼCbl-bを応用したオン・オフ調節が可能なCAR-T細胞受容体の作製:インタラクトームとして多様な結合分子を持つCbl-bの調節領域をCAR-T細胞受容体に導入し、Cbl-bとの結合が示されているT細胞シグナル伝達分子:キナーゼZap70、Grb2、Nck、Vav1、イノシトールリン酸化酵素PI3K、アダプター分子CIN85を指標としてCbl-bシグナルソームの形成を評価する。hCD19-CARとhCD5-CARのシグナルソーム形成の検証:臨床的にもhCD5-CARに比較して抗腫瘍効果の高いhCD19の分子メカニズムをシグナルソームの差違から明らかにする。hCD5-CARの分子イメージングシステムをhCD19-CARと同様に樹立し、hCD5-CARにリクルートする細胞内シグナル伝達分子Zap70、SLP-76、LAT、PI3K、PKCθの挙動を観察する。